动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105950732 A(43)申请公布日 2016.09.21

(21)申请号 201610354095.6(22)申请日 2016.05.25

(71)申请人 中国农业大学

地址 100094 北京市海淀区圆明园西路2号(72)发明人 吴聪明　崔明全　汪洋　(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限

公司 11245

代理人 关畅　白艳(51)Int.Cl.

C12Q 1/68(2006.01)C12N 15/11(2006.01)

权利要求书6页 说明书35页序列表35页 附图8页

(54)发明名称

动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片(57)摘要

本发明提供了动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片。本发明提供了用于鉴定动物源食品致病菌、致病菌耐药基因和/或致病菌毒力基因的探针，由序列1-序列171所示的单链DNA分子组成。本发明实验结果表明：本发明的动物源食品中致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片，能够有效的达到同时鉴定细菌及其毒力和耐药基因的综合目的。

CN 105950732 ACN 105950732 A

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1.一种鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因的成套探针，由序列1-序列171所示的单链DNA分子组成。

2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述成套探针中每条探针的5’末端均为氨基化修饰。

3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于：

所述动物源食品致病菌为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠球菌(Enterococcus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、大肠杆菌(E.coli)、弧菌(Vibrio)、弯曲菌(Campylobacter)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、变形杆菌属(Proteus spp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种；

和/或，所述沙门氏菌(Salmonella spp.)具体为鼠伤寒沙门(S.Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)、阿贡那沙门氏菌(S.Agona)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)中的至少一种；

和/或，所述大肠杆菌(E.coli)具体为EHEC肠出血性O157、EIEC侵袭性大肠杆菌中的至少一种；

和/或，所述弧菌(Vibrio)具体为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中的至少一种；

和/或，所述弯曲菌(Campylobacter)具体为空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)中的至少一种；

和/或，所述肠球菌(Enterococcus)具体为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)中的至少一种；

所述动物源食品致病菌耐药基因为：β内酰胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、大环内酯类耐药基因、林可酰胺类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、四环素耐药基因、氯霉素类耐药基因、糖肽类耐药基因、截短侧耳素类耐药基因、磺胺和甲氧苄啶类耐药基因和多耐药基因中的至少一种；

所述β内酰胺类耐药基因为mecA、CMY、CTX-M、DHA、IMP、KPC、OXA、PER、TEM、VIM、NDM、SHV、PSE中至少一种；

所述氨基糖苷类耐药基因为aac(3)-II、aac(3)-Iva、aac(6')-aph(2″)、aac(6')-Ib、aadA、aadD、ant(6)-I、armA、strA、strB中至少一种；

所述大环内酯类耐药基因为灭活酶ereA、ereB、外排泵mefA、甲基化酶ermA、ermB、ermC、ermF、mphA中至少一种；

所述林可酰胺类耐药基因为lnuE、lnuB、lnuA、msrA，喹诺酮类耐药基因：NorA、qnrB、qnrA、qnrS、qepA、qnrC、qnrD中至少一种；

所述四环素耐药基因为tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetL、tetO、TeA(P)、tetM、TetS中至少一种；

所述氯霉素类耐药基因为catA1、catA2、catA3、catA7、catA8、catA9、catB1、catB2、

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catB3、catB4、catB5、cmlA、floR、fexA、fexB中至少一种；

所述糖肽类耐药基因为vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanZ、vanM中至少一种；所述截短侧耳素类耐药基因为lsaA、lsaE、lsaB、lsaC、vgaA、vgaB、vgaC、vgaD、vgaE中至少一种；

所述磺胺和甲氧苄啶类耐药基因为sul1、sul2、sul3、dfr1、dfr6、dfr12、dfr17、dfrA、dfrG、dfrK中至少一种；

所述多耐药基因为cfr、oqxA、oqxB中至少一种；所述动物源食品致病菌特异基因和毒力基因为：沙门氏菌(Salmonella)invA和fimY特异基因、hilA毒力基因、鼠伤寒沙门血清型特异基因、肠炎沙门氏菌血清型特异基因、鸡沙门氏菌血清型特异基因、阿贡那沙门氏菌血清型特异基因、猪霍乱沙门氏菌血清型特异基因；肠球菌(Enterococcus)asal、gelE、cylA、esp、hyl毒力基因，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16S rRNA和菌株特异基因、屎肠球菌(Enterococcus faecium)16S rRNA和菌株特异基因、侵袭性大肠杆菌EIEC(enteroinvasive E.coli)virF、侵袭性质粒抗原ipaH基因；出血性大肠杆菌EHEC O157(enterohemorrhagic E.coli O157)stx1、stx2、eae、O157抗原rfbE基因；志贺氏菌属(Shigella spp.)侵袭性质粒抗原ipaH基因；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)cpa毒力基因；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)16S rRNA、rpoB基因和cytK、bceT、HBL毒力基因；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)16S rRNA和nuc基因；单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的16S rRNA和hly毒力基因；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)ail、yst毒力基因和16S rRNA基因；弯曲菌(Campylobacter)16S rRNA基因；结肠弯曲菌(Campylobacter coli)asp菌株特异基因；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)hip菌株特异基因；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)16S rRNA和ompW菌株特异基因；霍乱毒素ctxA毒力基因；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)16S rRNA基因、toxR和t l菌株特异基因、tdh、trh毒力基因；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)16S rRNA基因；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)16S rRNA和aerA毒力基因；变形杆菌(Proteus spp.)16S rRNA中至少一种。

4.一种于鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因的基因芯片，为将权利要求1-3中任一所述的探针固定在芯片上，得到基因芯片。

5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于：

所述动物源食品致病菌为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠球菌(Enterococcus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、大肠杆菌(E.coli)、弧菌(Vibrio)、弯曲菌(Campylobacter)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、变形杆菌属(Proteus spp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种；

和/或，所述沙门氏菌(Salmonella spp.)具体为鼠伤寒沙门(S.Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)、阿贡那沙门氏菌(S.Agona)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)中的至少一种；

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和/或，所述大肠杆菌(E.coli)具体为EHEC肠出血性O157、EIEC侵袭性大肠杆菌中的至少一种；

和/或，所述弧菌(Vibrio)具体为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中的至少一种；

和/或，所述弯曲菌(Campylobacter)具体为空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)中的至少一种；

和/或，所述肠球菌(Enterococcus)具体为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)中的至少一种；

所述动物源食品致病菌耐药基因为：β内酰胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、大环内酯类耐药基因、林可酰胺类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、四环素耐药基因、氯霉素类耐药基因、糖肽类耐药基因、截短侧耳素类耐药基因、磺胺和甲氧苄啶类耐药基因和多耐药基因中的至少一种；

所述β内酰胺类耐药基因为mecA、CMY、CTX-M、DHA、IMP、KPC、OXA、PER、TEM、VIM、NDM、SHV、PSE中至少一种；

所述氨基糖苷类耐药基因为aac(3)-II、aac(3)-Iva、aac(6')-aph(2″)、aac(6')-Ib、aadA、aadD、ant(6)-I、armA、strA、strB中至少一种；

所述大环内酯类耐药基因为灭活酶ereA、ereB、外排泵mefA、甲基化酶ermA、ermB、ermC、ermF、mphA中至少一种；

所述林可酰胺类耐药基因为lnuE、lnuB、lnuA、msrA，喹诺酮类耐药基因：NorA、qnrB、qnrA、qnrS、qepA、qnrC、qnrD中至少一种；

所述四环素耐药基因为tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetL、tetO、TeA(P)、tetM、TetS中至少一种；

所述氯霉素类耐药基因为catA1、catA2、catA3、catA7、catA8、catA9、catB1、catB2、catB3、catB4、catB5、cmlA、floR、fexA、fexB中至少一种；

所述糖肽类耐药基因为vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanZ、vanM中至少一种；所述截短侧耳素类耐药基因为lsaA、lsaE、lsaB、lsaC、vgaA、vgaB、vgaC、vgaD、vgaE中至少一种；

所述磺胺和甲氧苄啶类耐药基因为sul1、sul2、sul3、dfr1、dfr6、dfr12、dfr17、dfrA、dfrG、dfrK中至少一种；

所述多耐药基因为cfr、oqxA、oqxB中至少一种；所述动物源食品致病菌特异基因和毒力基因为：沙门氏菌(Salmonella)invA和fimY特异基因、hilA毒力基因、鼠伤寒沙门血清型特异基因、肠炎沙门氏菌血清型特异基因、鸡沙门氏菌血清型特异基因、阿贡那沙门氏菌血清型特异基因、猪霍乱沙门氏菌血清型特异基因；肠球菌(Enterococcus)asal、gelE、cylA、esp、hyl毒力基因，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16S rRNA和菌株特异基因、屎肠球菌(Enterococcus faecium)16S rRNA和菌株特异基因、侵袭性大肠杆菌EIEC(enteroinvasive E.coli)virF、侵袭性质粒抗原ipaH基因；出血性大肠杆菌EHEC O157(enterohemorrhagic E.coli O157)stx1、stx2、eae、O157抗原rfbE基因；志贺氏菌属(Shigella spp.)侵袭性质粒抗原ipaH基因；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)cpa毒力基因；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)16S rRNA、

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rpoB基因和cytK、bceT、HBL毒力基因；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)16S rRNA和nuc基因；单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的16S rRNA和hly毒力基因；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)ail、yst毒力基因和16S rRNA基因；弯曲菌(Campylobacter)16S rRNA基因；结肠弯曲菌(Campylobacter coli)asp菌株特异基因；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)hip菌株特异基因；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)16S rRNA和ompW菌株特异基因；霍乱毒素ctxA毒力基因；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)16S rRNA基因、toxR和t l菌株特异基因、tdh、trh毒力基因；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)16S rRNA基因；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)16S rRNA和aerA毒力基因；变形杆菌(Proteus spp.)16S rRNA中至少一种。

6.权利要求1-3中任一所述的探针或权利要求4或5所述的基因芯片在鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因中的应用；

或利要求1-3中任一所述的探针或权利要求4或5所述的基因芯片在制备鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因产品中的应用。

7.一种鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因的方法，包括如下步骤：

1)用随机引物对待测菌的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；2)荧光标记所述PCR扩增产物，得到标记后PCR扩增产物；

3)将标记后PCR扩增产物与权利要求4或5所述的基因芯片杂交，得到待检测基因芯片；4)检测所述待检测基因芯片，根据所述待检测基因芯片上某条探针所在的位置是否有荧光信号，确定所述样本为动物源食品致病菌哪种或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌毒力基因。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述用随机引物对待测菌的基因组DNA进行PCR扩增包括如下步骤：A、用序列172所示的引物扩增所述待测菌的基因组DNA，得到中间扩增产物；B、用序列173所示的引物扩增所述中间扩增产物，得到PCR扩增产物。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：

所述动物源食品致病菌为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠球菌(Enterococcus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、大肠杆菌(E.coli)、弧菌(Vibrio)、弯曲菌(Campylobacter)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、变形杆菌属(Proteus spp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种；

和/或，所述沙门氏菌(Salmonella spp.)具体为鼠伤寒沙门(S.Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)、阿贡那沙门氏菌(S.Agona)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)中的至少一种；

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和/或，所述大肠杆菌(E.coli)具体为EHEC肠出血性O157、EIEC侵袭性大肠杆菌中的至少一种；

和/或，所述弧菌(Vibrio)具体为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中的至少一种；

和/或，所述弯曲菌(Campylobacter)具体为空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)中的至少一种；

和/或，所述肠球菌(Enterococcus)具体为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)中的至少一种；

所述动物源食品致病菌耐药基因为：β内酰胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、大环内酯类耐药基因、林可酰胺类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、四环素耐药基因、氯霉素类耐药基因、糖肽类耐药基因、截短侧耳素类耐药基因、磺胺和甲氧苄啶类耐药基因和多耐药基因中的至少一种；

所述β内酰胺类耐药基因为mecA、CMY、CTX-M、DHA、IMP、KPC、OXA、PER、TEM、VIM、NDM、SHV、PSE中至少一种；

所述氨基糖苷类耐药基因为aac(3)-II、aac(3)-Iva、aac(6')-aph(2″)、aac(6')-Ib、aadA、aadD、ant(6)-I、armA、strA、strB中至少一种；

所述大环内酯类耐药基因为灭活酶ereA、ereB、外排泵mefA、甲基化酶ermA、ermB、ermC、ermF、mphA中至少一种；

所述林可酰胺类耐药基因为lnuE、lnuB、lnuA、msrA，喹诺酮类耐药基因：NorA、qnrB、qnrA、qnrS、qepA、qnrC、qnrD中至少一种；

所述四环素耐药基因为tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetL、tetO、TeA(P)、tetM、TetS中至少一种；

所述氯霉素类耐药基因为catA1、catA2、catA3、catA7、catA8、catA9、catB1、catB2、catB3、catB4、catB5、cmlA、floR、fexA、fexB中至少一种；

所述糖肽类耐药基因为vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanZ、vanM中至少一种；所述截短侧耳素类耐药基因为lsaA、lsaE、lsaB、lsaC、vgaA、vgaB、vgaC、vgaD、vgaE中至少一种；

所述磺胺和甲氧苄啶类耐药基因为sul1、sul2、sul3、dfr1、dfr6、dfr12、dfr17、dfrA、dfrG、dfrK中至少一种；

所述多耐药基因为cfr、oqxA、oqxB中至少一种；所述动物源食品致病菌特异基因和毒力基因为：沙门氏菌(Salmonella)invA和fimY特异基因、hilA毒力基因、鼠伤寒沙门血清型特异基因、肠炎沙门氏菌血清型特异基因、鸡沙门氏菌血清型特异基因、阿贡那沙门氏菌血清型特异基因、猪霍乱沙门氏菌血清型特异基因；肠球菌(Enterococcus)asal、gelE、cylA、esp、hyl毒力基因，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16S rRNA和菌株特异基因、屎肠球菌(Enterococcus faecium)16S rRNA和菌株特异基因、侵袭性大肠杆菌EIEC(enteroinvasive E.coli)virF、侵袭性质粒抗原ipaH基因；出血性大肠杆菌EHEC O157(enterohemorrhagic E.coli O157)stx1、stx2、eae、O157抗原rfbE基因；志贺氏菌属(Shigella spp.)侵袭性质粒抗原ipaH基因；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)cpa毒力基因；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)16S rRNA、

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rpoB基因和cytK、bceT、HBL毒力基因；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)16S rRNA和nuc基因；单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的16S rRNA和hly毒力基因；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)ail、yst毒力基因和16S rRNA基因；弯曲菌(Campylobacter)16S rRNA基因；结肠弯曲菌(Campylobacter coli)asp菌株特异基因；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)hip菌株特异基因；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)16S rRNA和ompW菌株特异基因；霍乱毒素ctxA毒力基因；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)16S rRNA基因、toxR和t l菌株特异基因、tdh、trh毒力基因；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)16S rRNA基因；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)16S rRNA和aerA毒力基因；变形杆菌(Proteus spp.)16S rRNA中至少一种。

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动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片

技术领域

[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片。

背景技术

[0002]动物源食品中致病菌导致的疾病一直是发展中国家和发达国家广泛关注的公共卫生问题之一。控制食品污染和食源性疾病被世界卫生组织(WHO)列为优先战略领域范畴。我国作为最大的发展中国家，食源性疾病监测网的建立尚不健全。近年来，微生物病原菌是

各种食源性病原菌自身的生物毒素与细菌的致病力导致食源性疾病爆发的主要原因之一。

密切相关，与此同时，其中很多毒力基因也可以作为食源性致病菌的鉴别基因。随着食源性病原菌中耐药基因在人畜之间的传播，直接影响了人们对治疗食源性病原菌疾病的治疗效果。因此，综合针对食源性病原菌病原鉴定，及其主要毒力基因和耐药基因三个方面的鉴定，建立一套系统，快捷，高通量的检测办法，可以有效地促进我国公共卫生事业的发展。[0003]目前，分别针对动物源食品中致病菌鉴定、毒素鉴定、耐药鉴定的传统生物生化方法，试验周期长，实验室工作量大、个别试验检测灵敏度低。综合以上特点，不能高效准确地应对公共卫生突发性事件。目前，NCBI数据库已经建立了多种病原微生物基因组和耐药基因序列数据信息。20世纪90年代发明基因芯片技术，将寡核苷酸分子固定于固相载体上，形成DNA微阵列，将样品核酸荧光标记，与芯片探针杂交，通过芯片分析系统获得大量检测信息；该项技术具有微型化，高通量，高准确性，高灵敏度的技术优点。发明内容

[0004]本发明的一个目的是一种提供鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因的成套探针。[0005]本发明提供的成套探针，由序列1-序列171所示的单链DNA分子组成。[0006]上述探针中，所述成套探针中每条探针的5’末端均为氨基化修饰。[0007]上述探针中，所述动物源食品致病菌为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠球菌(Enterococcus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、大肠杆菌(E.coli)、弧菌(Vibrio)、弯曲菌(Campylobacter)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、变形杆菌属(Proteus spp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种；[0008]和/或，所述沙门氏菌(Salmonella spp.)具体为鼠伤寒沙门(S.Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)、阿贡那沙门氏菌(S.Agona)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)中的至少一种；

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和/或，所述大肠杆菌(E.coli)具体为EHEC肠出血性O157、EIEC侵袭性大肠杆菌中

的至少一种；[0010]和/或，所述弧菌(Vibrio)具体为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中的至少一种；[0011]和/或，所述弯曲菌(Campylobacter)具体为空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)中的至少一种；[0012]和/或，所述肠球菌(Enterococcus)具体为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)中的至少一种；[0013]所述动物源食品致病菌耐药基因为：β内酰胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、大环内酯类耐药基因、林可酰胺类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、四环素耐药基因、氯霉素类耐药基因、糖肽类耐药基因、截短侧耳素类耐药基因、磺胺和甲氧苄啶类耐药基因和多耐药基因中的至少一种；[0014]所述β内酰胺类耐药基因为mecA、CMY、CTX-M、DHA、IMP、KPC、OXA、PER、TEM、VIM、NDM、SHV、PSE中至少一种；

[0015]所述氨基糖苷类耐药基因为aac(3)-II、aac(3)-Iva、aac(6')-aph(2″)、aac(6')-Ib、aadA、aadD、ant(6)-I、armA、strA、strB中至少一种；[0016]所述大环内酯类耐药基因为灭活酶ereA、ereB、外排泵mefA、甲基化酶ermA、ermB、ermC、ermF、mphA中至少一种；

[0017]所述林可酰胺类耐药基因为lnuE、lnuB、lnuA、msrA，喹诺酮类耐药基因：NorA、qnrB、qnrA、qnrS、qepA、qnrC、qnrD中至少一种；[0018]所述四环素耐药基因为tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetL、tetO、TeA(P)、tetM、TetS中至少一种；

[0019]所述氯霉素类耐药基因为catA1、catA2、catA3、catA7、catA8、catA9、catB1、catB2、catB3、catB4、catB5、cmlA、floR、fexA、fexB中至少一种；[0020]所述糖肽类耐药基因为vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanZ、vanM中至少一种；[0021]所述截短侧耳素类耐药基因为lsaA、lsaE、lsaB、lsaC、vgaA、vgaB、vgaC、vgaD、vgaE中至少一种；

[0022]所述磺胺和甲氧苄啶类耐药基因为sul1、sul2、sul3、dfr1、dfr6、dfr12、dfr17、dfrA、dfrG、dfrK中至少一种；[0023]所述多耐药基因为cfr、oqxA、oqxB中至少一种；[0024]所述动物源食品致病菌特异基因和毒力基因为：沙门氏菌(Salmonella)invA和fimY特异基因、hilA毒力基因、鼠伤寒沙门血清型特异基因、肠炎沙门氏菌血清型特异基因、鸡沙门氏菌血清型特异基因、阿贡那沙门氏菌血清型特异基因、猪霍乱沙门氏菌血清型特异基因；肠球菌(Enterococcus)asal、gelE、cylA、esp、hyl毒力基因，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16S rRNA和菌株特异基因、屎肠球菌(Enterococcus faecium)16S rRNA和菌株特异基因、侵袭性大肠杆菌EIEC(enteroinvasive E.coli)virF、侵袭性质粒抗原ipaH基因；出血性大肠杆菌EHEC O157(enterohemorrhagic E.coli O157)stx1、stx2、eae、O157抗原rfbE基因；志贺氏菌属(Shigella spp.)侵袭性质粒抗原ipaH基因；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)cpa毒力基因；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)

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16S rRNA、rpoB基因和cytK、bceT、HBL毒力基因；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)16S rRNA和nuc基因；单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的16S rRNA和hly毒力基因；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)ail、yst毒力基因和16S rRNA基因；弯曲菌(Campylobacter)16S rRNA基因；结肠弯曲菌(Campylobacter coli)asp菌株特异基因；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)hip菌株特异基因；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)16S rRNA和ompW菌株特异基因；霍乱毒素ctxA毒力基因；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)16S rRNA基因、toxR和t l菌株特异基因、tdh、trh毒力基因；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)16S rRNA基因；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)16S rRNA和aerA毒力基因；变形杆菌(Proteus spp.)16S rRNA中至少一种。[0025]本发明另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因的基因芯片。[0026]本发明提供的基因芯片，为将上述的探针固定在芯片上，得到基因芯片。[0027]上述基因芯片中，所述动物源食品致病菌为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠球菌(Enterococcus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、大肠杆菌(E.coli)、弧菌(Vibrio)、弯曲菌(Campylobacter)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、变形杆菌属(Proteus spp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种；[0028]和/或，所述沙门氏菌(Salmonella spp.)具体为鼠伤寒沙门(S.Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)、阿贡那沙门氏菌(S.Agona)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)中的至少一种；[0029]和/或，所述大肠杆菌(E.coli)具体为EHEC肠出血性O157、EIEC侵袭性大肠杆菌中的至少一种；[0030]和/或，霍所述弧菌(Vibrio)具体为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、乱弧菌(Vibrio cholerae)中的至少一种；[0031]和/或，所述弯曲菌(Campylobacter)具体为空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)中的至少一种；[0032]和/或，所述肠球菌(Enterococcus)具体为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)中的至少一种；[0033]所述动物源食品致病菌耐药基因为：β内酰胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、大环内酯类耐药基因、林可酰胺类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、四环素耐药基因、氯霉素类耐药基因、糖肽类耐药基因、截短侧耳素类耐药基因、磺胺和甲氧苄啶类耐药基因和多耐药基因中的至少一种；[0034]所述β内酰胺类耐药基因为mecA、CMY、CTX-M、DHA、IMP、KPC、OXA、PER、TEM、VIM、NDM、SHV、PSE中至少一种；

[0035]所述氨基糖苷类耐药基因为aac(3)-II、aac(3)-Iva、aac(6')-aph(2″)、aac(6')-Ib、aadA、aadD、ant(6)-I、armA、strA、strB中至少一种；

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所述大环内酯类耐药基因为灭活酶ereA、ereB、外排泵mefA、甲基化酶ermA、ermB、

ermC、ermF、mphA中至少一种；

[0037]所述林可酰胺类耐药基因为lnuE、lnuB、lnuA、msrA，喹诺酮类耐药基因：NorA、qnrB、qnrA、qnrS、qepA、qnrC、qnrD中至少一种；[0038]所述四环素耐药基因为tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetL、tetO、TeA(P)、tetM、TetS中至少一种；

[0039]所述氯霉素类耐药基因为catA1、catA2、catA3、catA7、catA8、catA9、catB1、catB2、catB3、catB4、catB5、cmlA、floR、fexA、fexB中至少一种；[0040]所述糖肽类耐药基因为vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanZ、vanM中至少一种；[0041]所述截短侧耳素类耐药基因为lsaA、lsaE、lsaB、lsaC、vgaA、vgaB、vgaC、vgaD、vgaE中至少一种；

[0042]所述磺胺和甲氧苄啶类耐药基因为sul1、sul2、sul3、dfr1、dfr6、dfr12、dfr17、dfrA、dfrG、dfrK中至少一种；[0043]所述多耐药基因为cfr、oqxA、oqxB中至少一种；[0044]所述动物源食品致病菌特异基因和毒力基因为：沙门氏菌(Salmonella)invA和fimY特异基因、hilA毒力基因、鼠伤寒沙门血清型特异基因、肠炎沙门氏菌血清型特异基因、鸡沙门氏菌血清型特异基因、阿贡那沙门氏菌血清型特异基因、猪霍乱沙门氏菌血清型特异基因；肠球菌(Enterococcus)asal、gelE、cylA、esp、hyl毒力基因，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16S rRNA和菌株特异基因、屎肠球菌(Enterococcus faecium)16S rRNA和菌株特异基因、侵袭性大肠杆菌EIEC(enteroinvasive E.coli)virF、侵袭性质粒抗原ipaH基因；出血性大肠杆菌EHEC O157(enterohemorrhagic E.coli O157)stx1、stx2、eae、O157抗原rfbE基因；志贺氏菌属(Shigella spp.)侵袭性质粒抗原ipaH基因；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)cpa毒力基因；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)16S rRNA、rpoB基因和cytK、bceT、HBL毒力基因；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)16S rRNA和nuc基因；单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的16S rRNA和hly毒力基因；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)ail、yst毒力基因和16S rRNA基因；弯曲菌(Campylobacter)16S rRNA基因；结肠弯曲菌(Campylobacter coli)asp菌株特异基因；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)hip菌株特异基因；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)16S rRNA和ompW菌株特异基因；霍乱毒素ctxA毒力基因；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)16S rRNA基因、toxR和t l菌株特异基因、tdh、trh毒力基因；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)16S rRNA基因；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)16S rRNA和aerA毒力基因；变形杆菌(Proteus spp.)16S rRNA中至少一种。[0045]上述的探针或上述的基因芯片在鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因中的应用也是本发明保护的范围；

[0046]或上述的探针或上述的基因芯片在制备鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因产品中的应用也是本发明保护的范围。

[0047]本发明第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌

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或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因的方法。[0048]本发明提供的方法，包括如下步骤：

[0049]1)用随机引物对待测菌的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；[0050]2)荧光标记所述PCR扩增产物，得到标记后PCR扩增产物；[0051]3)将标记后PCR扩增产物与上述的基因芯片杂交，得到待检测基因芯片；[0052]4)检测所述待检测基因芯片，根据所述待检测基因芯片上某条探针所在的位置是否有荧光信号，确定所述样本为动物源食品致病菌哪种或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因。[0053]上述方法中，

[0054]所述用随机引物对待测菌的基因组DNA进行PCR扩增包括如下步骤：[0055]A、用序列172所示的引物扩增所述待测菌的基因组DNA，得到中间扩增产物；[0056]B、用序列173所示的引物扩增所述中间扩增产物，得到PCR扩增产物。[0057]上述方法中，所述动物源食品致病菌为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠球菌(Enterococcus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、大肠杆菌(E.coli)、弧菌(Vibrio)、弯曲菌(Campylobacter)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、变形杆菌属(Proteus spp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种；[0058]和/或，所述沙门氏菌(Salmonella spp.)具体为鼠伤寒沙门(S.Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)、阿贡那沙门氏菌(S.Agona)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)中的至少一种；[0059]和/或，所述大肠杆菌(E.coli)具体为EHEC肠出血性O157、EIEC侵袭性大肠杆菌中的至少一种；[0060]和/或，霍所述弧菌(Vibrio)具体为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、乱弧菌(Vibrio cholerae)中的至少一种；[0061]和/或，所述弯曲菌(Campylobacter)具体为空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)中的至少一种；[0062]和/或，所述肠球菌(Enterococcus)具体为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)中的至少一种；[0063]所述动物源食品致病菌耐药基因为：β内酰胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、大环内酯类耐药基因、林可酰胺类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、四环素耐药基因、氯霉素类耐药基因、糖肽类耐药基因、截短侧耳素类耐药基因、磺胺和甲氧苄啶类耐药基因和多耐药基因中的至少一种；[0064]所述β内酰胺类耐药基因为mecA、CMY、CTX-M、DHA、IMP、KPC、OXA、PER、TEM、VIM、NDM、SHV、PSE中至少一种；

[0065]所述氨基糖苷类耐药基因为aac(3)-II、aac(3)-Iva、aac(6')-aph(2″)、aac(6')-Ib、aadA、aadD、ant(6)-I、armA、strA、strB中至少一种；

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所述大环内酯类耐药基因为灭活酶ereA、ereB、外排泵mefA、甲基化酶ermA、ermB、

ermC、ermF、mphA中至少一种；

[0067]所述林可酰胺类耐药基因为lnuE、lnuB、lnuA、msrA，喹诺酮类耐药基因：NorA、qnrB、qnrA、qnrS、qepA、qnrC、qnrD中至少一种；[0068]所述四环素耐药基因为tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetL、tetO、TeA(P)、tetM、TetS中至少一种；

[0069]所述氯霉素类耐药基因为catA1、catA2、catA3、catA7、catA8、catA9、catB1、catB2、catB3、catB4、catB5、cmlA、floR、fexA、fexB中至少一种；[0070]所述糖肽类耐药基因为vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanZ、vanM中至少一种；[0071]所述截短侧耳素类耐药基因为lsaA、lsaE、lsaB、lsaC、vgaA、vgaB、vgaC、vgaD、vgaE中至少一种；

[0072]所述磺胺和甲氧苄啶类耐药基因为sul1、sul2、sul3、dfr1、dfr6、dfr12、dfr17、dfrA、dfrG、dfrK中至少一种；[0073]所述多耐药基因为cfr、oqxA、oqxB中至少一种；[0074]所述动物源食品致病菌特异基因和毒力基因为：沙门氏菌(Salmonella)invA和fimY特异基因、hilA毒力基因、鼠伤寒沙门血清型特异基因、肠炎沙门氏菌血清型特异基因、鸡沙门氏菌血清型特异基因、阿贡那沙门氏菌血清型特异基因、猪霍乱沙门氏菌血清型特异基因；肠球菌(Enterococcus)asal、gelE、cylA、esp、hyl毒力基因，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16S rRNA和菌株特异基因、屎肠球菌(Enterococcus faecium)16S rRNA和菌株特异基因、侵袭性大肠杆菌EIEC(enteroinvasive E.coli)virF、侵袭性质粒抗原ipaH基因；出血性大肠杆菌EHEC O157(enterohemorrhagic E.coli O157)stx1、stx2、eae、O157抗原rfbE基因；志贺氏菌属(Shigella spp.)侵袭性质粒抗原ipaH基因；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)cpa毒力基因；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)16S rRNA、rpoB基因和cytK、bceT、HBL毒力基因；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)16S rRNA和nuc基因；单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的16S rRNA和hly毒力基因；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)ail、yst毒力基因和16S rRNA基因；弯曲菌(Campylobacter)16S rRNA基因；结肠弯曲菌(Campylobacter coli)asp菌株特异基因；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)hip菌株特异基因；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)16S rRNA和ompW菌株特异基因；霍乱毒素ctxA毒力基因；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)16S rRNA基因、toxR和t l菌株特异基因、tdh、trh毒力基因；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)16S rRNA基因；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)16S rRNA和aerA毒力基因；变形杆菌(Proteus spp.)16S rRNA中至少一种。[0075]本发明实验结果表明：本发明的动物源食品中致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片，能够有效的达到同时鉴定细菌及其毒力和耐药基因的综合目的；针对含有171条探针中等密度布局的芯片，选择全基因DNA扩增技术，对标准和临床细菌菌株的全基因组DNA直接进行全基因组扩增、标记和检测。其中用于参照菌株阳性基因均能够被有效检测。并且对临床盲测菌株检测结果显示，芯片检测性能发挥具有高效性。其次同时结合了其中一组多重PCR扩增芯片检测结果，结果表明，芯片杂交特异性好。[0076]与现有技术相比，本发明具有如下优点：

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(1)芯片检测对象多功能化：本发明基因芯片中的探针检测对象包括了：食源性病

原菌的病原鉴定，部分毒力基因鉴定和耐药基因鉴定三方面功能融合于同一检测芯片平台；

[0078](2)检测应用性强：其中radom-PCR单一扩增策略的实施，即可实现了解动物源食品中致病菌的多方面信息；

[0079](3)多种扩增策略融合于同一检测芯片：本发明基因芯片探针的设计，可以集合使用了三种主流PCR扩增策略，针对不同临床应用需求灵活选择扩增策略，增加了芯片应用的选择性；

[0080](4)高通量：对于多种类基因的高通量平行检测；[0081](5)易于自动化及检测。

附图说明

[0082]图1为芯片探针布局图。

[0083]图2为本发明芯片用于检测动物源标准和临床菌株的检测结果。[0084]图3为盲测菌株的基因芯片检测结果。[0085]图4为多重PCR电泳检测结果。[0086]图5为芯片检测结果。

具体实施方式

[0087]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0088]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0089]实施例1、复合检测基因芯片的制备[0090]为了同时达到病源菌鉴定、毒力基因鉴定和耐药基因鉴定的三重目的，建立一种同时检测14种动物源食品中致病菌及其相关毒力和耐药基因的芯片检测平台。复合检测基因芯片上所点置的171条寡核苷酸探针涉及并包含了14种常见动物源食品中致病细菌鉴定的特异性基因、11种致病菌的16S rRNA基因和部分细菌的毒力基因，以及我国耐药监测领域所涉及的常见耐药基因。其中部分检测探针可灵活地被应用于灵敏度高的多重PCR扩增和16S rRNA-PCR单重扩增芯片检测。该复合芯片所具备的特色使其可以被灵活地应用于临床相关动物源食品中致病菌鉴定、毒力基因检测及耐药基因调查。

[0091]动物源食品中致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片的研制方案如下：[0092]1、芯片检测对象、核酸扩增方案以及探针的设计[0093]首先，根据芯片检测的应用对象，选取预设芯片的检测基因对象和其对应的核酸扩增策略。

[0094]其次，根据芯片探针设计试验相关要求，利用相关生物信息分析软件：引物探针设

序列进化分析软件MEGA4.0；多重PCR引物设计软件Premierplex2.0；芯计软件Premier5.0；

片探针设计软件Arraydesigner4.0；序列比对分析软件Bioedit和DNAMAN。具体探针设计要求：选择探针长度为28-32nt,退火参数设置：Tm为65±5℃和GC％为40-60％。经Arraydesigner4.0生物学软件初步筛选，再经人工筛选探针。与此同时将参数合格的探针成员进行NCBI Blast比对验证其保守性，最终确定点置探针成员。对其点置的芯片探针的

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5’末端进行氨基化修饰并附加ploy-T。使其探针最终为42nt。[0095]探针设计的具体标准如下：[0096]高度的特异性和保守性。在NCBI数据库中，尽可能多收集食源性病原菌16S rRNA基因、毒力基因和耐药基因的相应序列信息，比对序列的进化树和同源性。选择基因序列的高保守区，以保证探针的特异性和敏感性，同时应该规避和降低与其它非靶标基因序列的同源性。

[0097]探针选择标准：

[0098](1)尽可能避免发夹和自身二聚体结构；[0099](2)避免在G、C富集区域选择探针；[0100](3)避免5个以上的重复碱基结构；[0101](4)不可避免得，探针的差异碱基尽可能地分需要在同源性高的区域选择探针时，布在探针3’端。[0102]最终，根据预设芯片检测基因在NCBI数据库中的生物信息学信息反馈。14种常见动物源食品中致病菌的16S rRNA基因序列进行树分析结果显示：大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌三个菌属的之间的16S rRNA基因序列同源性相似性极高，不具备利用16S rRNA基因检测以上该三种细菌的客观条件，因此摒弃了针对这三个菌属16S rRNA基因探针的设计，而选择了针对其他11种致病菌属种16S rRNA基因探针的设计，最终确定点置探针共计14条；检测部分致病菌毒力或看家特异基因探针共45条；涉及检测耐药基因探针共计112条。探针5’末端经氨基化修饰并附加ploy-T之后，涉及探针序列具体如表1所示：[0103]表1为经氨基化修饰后的探针序列

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注释：耐药基因探针为1-107,167-171；

[0114]16S rRNA为111-117、120、124、125、127-129、131；[0115]细菌特异性鉴定基因为：118、132-137、143-154、158、159、162-165；[0116]细菌毒力基因为：108-110、119、121-123、126、130、132、138-142、145-152、154-157、160、161、166。

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其中，以上探针编号重复归类成员，即为特异鉴定基因又为毒力基因探针；另外，

同样基因命名而不同的探针编号成员，属于针对该基因设计的不同探针成员。[0118]为了区分本实验中芯片应用策略的不同：多重PCR策略应用芯片时，P探针为#序列，随机引物PCR应用芯片时，P探针为N序列。[0119]2、复合检测基因芯片的布局设计及探针点制[0120]设计合成表1所示的探针。[0121]探针溶解：将每条合成好的探针分别12000rpm离心15min,按每OD 20μL体积加入50％DMSO进行溶解，4℃储存备用。[0122]芯片点制：根据探针分布图(图1，N表示为阴性探针；DMSO表示为二甲基亚砜；P/#表示为路标对照探针)，进行芯片点制，然后于37℃烘干过夜，得到复合检测基因芯片。[0123]实施例2、复合检测基因芯片的应用[0124]一、待杂交样本的获得[0125]1、样本核酸的提取

[0126]根据基因芯片预检测对象的确定，采用Genomic DNA Purification Kit试剂盒,按照研究说明书提取表2所示的待测菌的DNA，得到每个菌的基因组DNA。[0127]将每个菌的基因组DNA分别进行如下实验：[0128]2、随机引物PCR扩增待杂交样本[0129]1)PrimerA反应：[0130]DNA反应液1：将400ng基因组DNA，2.5μL的PrimerA(PrimerA:GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN(序列172))，6μL MQ H2O混合之后，95℃预变性5min，然后，立即放在冰上，得到DNA反应液1；[0131]混合液2：将2.5μL dNTP(Takara公司Code:R001A))，23μL MQ H2O混匀，得到混合液2。

[0132]将混合液2加入DNA反应液1中，运行反应程序：95℃5min，然后立即放入冰中2-5min；然后再循环4℃10s，72℃1min(0.1℃/s)反应程序。最后对其产物进行电泳检测，用

得到产物A。Millipore MultiScreen PCR96孔滤膜板系列(Cat No:MSNU03050)进行纯化，

[0133]2)PrimerB反应：[0134]将20μL的上述1)得到的产物A，1μL PrimerB(PrimerB:GTTTCCCAGTCACGATC(序列173))，20.5μL MQ H2O，2.5μL dNTP(Takara公司Code:R001A)，5μL 10×buffer(Takara公司Code:R001A)，1μL rTaq酶(Takara公司Code:R001A)和水混匀，得到50μL反应体系。[0135]将上述反应体系进行扩增，反应程序：95℃5min，95℃30s；45℃30s，55℃30s，72℃30s，72℃1min 35cycles；72℃5min，4℃；得到产物B。[0136]3、荧光标记[0137]1)扩增

[0138]对上述2得到的产物B进行单标扩增，反应体系如下：[0139]40μL PCR体系：1μL PrimerB，20.5μL MQ H2O，4μL 10×buffer，1μL rTaq酶,1μL cy3荧光染料(GE Healthcare)，2.5μL dNTP。[0140]扩增反应程序：95℃5min，95℃30s；45℃30s，55℃30s，72℃30s，72℃1min 35cycles；72℃5min，4℃。

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得到PCR扩增产物。

[0142]2)纯化：

[0143]利用QIAGEN PCR Purification Kit(Code:28104)对上述1)得到的PCR扩增产物进行纯化处理，步骤如下：[0144](1)40μL上述1)得到的PCR扩增产物和300μL Bufffer PB,加入柱子中混合，避光静置2min；

[0145](2)8000rpm离心1min,弃废液；[0146](3)加700μL Wash Buffer PE,8000rpm离心1min,弃废液；[0147](4)12000rpm离心1min,弃废液并更换新管，室温静置2min；[0148](5)将DNA回溶于30μL MQ H2O中；[0149](6)至42℃烘箱烘干回收产物，避光备用，等候芯片正式杂交，得到待杂交PCR产物。

[0150]二、芯片杂交[0151]1、芯片的预杂交：

[0152]实施例1制备的复合检测基因芯片在预杂交液(5×SSC，1％SDS，0.1mg/μL BSA)42℃水浴中预杂交1h；随后在常温洗液1(250μL 20×SSC，49.75mL MQ H2O)中洗涤5min,然后在50mL的MQ H2O中洗涤30s，最后室温放置，等候芯片正式杂交，得到预处理后芯片。[0153]2、芯片的杂交：[0154]将20μL杂交液(5×SSC，0.1％SDS，0.1mg/μL BSA，0.1％鲑鱼精DNA，甲酰胺)加入干燥好的单标产物管中，并转移至PCR试管中与上述一获得的30μL待杂交PCR产物混匀，95℃5min,42℃5min，得到杂交混合液。随后将杂交混合液加到预处理后芯片的矩阵上，在此过程中避免产生气泡和触碰芯片矩阵表面，盖上玻片，装到杂交仓中，放入水浴锅，40℃，杂交16h，得到杂交芯片。[0155]3、芯片的洗涤：

[0156]将上述2得到的杂交芯片从杂交仓中取出，放到芯片架上进行以下洗涤步骤：[0157]1)、在洗液A(20×SSC，30mL；10％SDS，6mL；MQ H2O，564mL)中快速提拉芯片架，充分冲洗整张芯片，洗涤3min；[0158]2)、将芯片在洗液B(1.5mL 20×SSC，；598mL MQ H2O，)中洗涤3min；[0159]3)、将芯片在洗液C(无水乙醇)中洗涤3min；[0160]4)、用吹风机的自然风档将芯片吹干，得到待检测芯片。[0161]三、芯片检测

[0162]将上述二获得的待检测芯片用芯片扫描软件GenePix Pro 6.0扫描，并根据调整合适的信号背景。若芯片上某条探针所在的位置有荧光信号，则待测菌为或候选为该条探针对应的动物源食品致病菌，或待测菌含有或候选含有该条探针对应的动物源食品致病菌耐药基因或动物源食品致病菌毒力基因；若某条探针所在的位置没有荧光信号，则待测菌不为或候选不为该条探针对应的动物源食品致病菌，或待测菌不含有或候选不含有该条探针对应的动物源食品致病菌耐药基因或动物源食品致病菌毒力基因。[0163]结果如图2和表2所示，阳性菌株的阳性探针均得到阳性杂交结果。[0164]表2为复合检测基因芯片对携带阳性靶标基因待测菌的检测结果

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注释：加粗基因为最初收集携带的阳性参照基因，用于验证评估芯片探针性能，其

余的未加粗的基因为验证时，额外发现的阳性基因；/:表示未检测到该类基因。[0176]ATCC,美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)

[0177]CICC,中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)

[0178]CMCC,中国医学微生物菌种保藏管理中心(China Microbiological Culture Collection CMCC)HN5受赠于华南农业大学携带有阳性参照基因临床菌株[0179]10082805，A10052，Z5，925，120904136，11-2受赠于浙江大学携带有阳性参照基因临床菌株

[0180]70d,CMQ2,CMQ5,CMQ9,CMQ16,CMQ17,CMQ19,CMQ20,CMQ27,A-1,A-2,B-7,B-8,C-12,vgaE,vgaA,均来自于中国农业大学临床菌株和质粒，其中部分菌株有文献出处：

[0181]vgaE,出自文献Identification of a novel vga(E)gene variant that confers resistance to pleuromutilins,lincosamides and streptogramin A antibiotics in staphylococci of porcine origin vgaA,金黄色葡萄球菌pVGA质粒GenBank:NC011605[0182]70d，出自文献Unique Class 1Integron and Multiple Resistance Genes Co-located on IncHI2Plasmid Is Associated with the Emerging Multidrug Resistance of Salmonella Indiana Isolated from Chicken in China[0183]A-1，出自文献Characterization of a genomic island in Stenotrophomonas maltophilia that carries a novel floR gene variant[0184]A-2，出自文献Genetic environment of the multi-resistance gene cfr in methicillin-resistantcoagulase-negative staphylococci from chickens,ducks,and pigs in China

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CMQ5,出自文献First Report of the Multidrug Resistance Gene cfr in 

Enterococcus faecalis of Animal Origin[0186]1530，出自文献Identification of Multiresistance Gene cfr in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus from Pigs:Plasmid Location and Integration into a Staphylococcal Cassette Chromosomemec Complex[0187]CMQ9，出自文献Identification of the Novel Lincosamide Resistance Gene lnu(E)Truncated by ISEnfa5-cfr-ISEnfa5Insertion in Streptococcus suis:De Novo Synthesis and Confirmation of Functional Activity in Staphylococcus aureus[0188]非O1群霍乱弧菌VbO购自上海复祥生物科技有限公司[0189]81-176来自本实验室储存标准菌株。[0190]实施例3、复合检测基因芯片进行盲测检验[0191]一、待杂交样本的获得[0192]1、样本核酸的提取

[0193]用于盲测的检测菌株为在商品猪分离的一株MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)，另外一株是从鸡肉加工链分离到一株沙门氏菌。[0194]提取MRSA和沙门氏菌的基因组DNA。[0195]2、随机引物PCR扩增待杂交样本：与实施例2相同。[0196]3、荧光标记：与实施例2相同。[0197]二、芯片杂交：与实施例2相同。[0198]三、芯片检测

[0199]方法与实施例2相同，结果如图3A所示。[0200]根据芯片检测结果显示：两种菌细菌鉴定均得到准确鉴定，与此同时检测获得两个菌株相关耐药基因的检测结果，如图3A所示。

[0201]猪源MRSA的芯片检测到的芯片目的基因有：aac(6')-aph(2″)(对应探针3)、aadD(对应探针6)、mecA(对应探针11)、strB(对应探针10)、OXA(对应探针20)、ermC(对应探针35)、NorA(对应探针44)、lnuB(对应探针38)、fexA(对应探针70)、lsaE(对应探针84)、金黄色葡萄球菌16S rRNA(对应探针112)、eae(对应探针147)、nuc(对应探针158)、tetL(对应探针169)。

[0202]鸡肉源沙门氏菌芯片检测目的基因有：aac(3)-Iva(对应探针2)、strA(对应探针9)、strB(对应探针10)、OXA(对应探针19)、qepA(对应探针45)、catB3(对应探针65)、cmlA(对应探针68)、floR(对应探针69)、sul1(对应探针94)、sul2(对应探针95)、dfr17(对应探针100)、hilA(对应探针119)、invA(对应探针132)、eae(对应探针147)、tetM(对应探针170)。

[0203]四、PCR检测电泳图验证芯片结果[0204]PCR检测：20μL PCR扩增体系为10μL Premix Ex Taq(Takara公司Code:RR 003A)、1μL浓度均为10μmol/L耐药基因的特异性上下游引物和超纯水装入一无菌的PCR反应薄壁管中，加水至总体积为19μL；再向其中加入1μL细菌基因组DNA作为模板，即可形成PCR扩增体系。具体使用检测引物如下表3：[0205]表3为使用检测引物

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PCR扩增循环参数为：95℃5min；95℃40s，62℃40s，72℃45s，30个循环；72℃5min。

[0210]得到PCR产物。取7μL的PCR产物，点样于1％琼脂糖凝胶电泳板孔中，150V电压，电泳25min,通过凝胶成像系统获取图片。检测结果如图3B所示，其中M为TAKARA DL2000DNA marker(Takara公司Code:Q3427A)，耐药基因及其片段大小见标记。[0211]根据如图3B所示所示结果，猪源MRSA PCR检测结果：eae为非特异性检测，即为假阳性；其他均为阳性,与基因芯片检测结果一致。[0212]鸡肉源沙门氏菌PCR检测结果：eae，qepA为非特异性检测，即为假阳性；其他均为阳性，与基因芯片检测结果一致。[0213]实施例4、复合检测基因芯片检测多种待测菌[0214]应用多重-PCR扩增策略，利用本发明基因芯片分别对小肠耶尔森氏菌ATCC21669、副溶血弧菌ATCC21617、空肠弯曲菌ATCC33560、非O1群霍乱弧菌vbO、结肠弯曲菌ATCC33559五种致病菌的检测。[0215]一、待杂交样本的获得[0216]1、样本核酸的提取

[0217]小肠耶尔森氏菌ATCC21669、副溶血弧菌ATCC21617、空肠弯曲菌ATCC33560、非O1群霍乱弧菌vbO和结肠弯曲菌ATCC33559。[0218]2、靶基因的多重PCR扩增[0219]PCR扩增50μL反应体系：10×Buffer 5μL；dNTP 1μL；rTaq 0.5μL；Primer混合：(小肠耶尔森氏菌ail靶基因上下游引物分别0.25μL，yst靶基因上下游引物分别为0.35μL；结肠弯曲菌asp靶基因上下游引物分别0.35μL；霍乱弧菌靶基因ompW上下游引物分别0.2μL；空肠弯曲菌hip上下游引物分别0.3μL；副溶血弧菌靶基因toxR上下游引物分别0.25μL)基因组模板(50ng/μL)1μL。具体扩增信息如表4所示[0220]表4多重PCR引物信息表

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反应参数为：95℃5min；95℃40s，60℃40s，72℃45s，30个循环；72℃5min反应结束

后，PCR扩增产物经3％的琼脂糖凝胶(含0.05μL/ml的EB)电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，100V恒压电泳30min，紫外灯下检测电泳结果。[0224]结果如图4所示，21669：小肠耶尔森氏菌ATCC21669；21617：副溶血弧菌ATCC21617；33560：空肠弯曲菌ATCC33560；vbO非O1群霍乱弧菌vbO；33559:结肠弯曲菌ATCC33559；M：Takara公司100bp DAN marker(Code:3422A)；得到目的片段。[0225]QIAGEN纯化试剂盒按照案例1中的说明对PCR扩增产物进行纯化。[0226]3、单链标记[0227]按照50μL的标记体系对扩增产物进行单链标记：10×Buffer 5μL；dNTP 1μL；Primer下游引物混合(小肠耶尔森氏菌ail靶基因上下游引物分别0.5μL，yst靶基因上下游引物分别为0.7μL；结肠弯曲菌asp靶基因上下游引物分别0.7μL；霍乱弧菌靶基因ompW上下游引物分别0.4μL；空肠弯曲菌hip上下游引物分别0.6μL；副溶血弧菌靶基因toxR上下游引

μL。物分别0.5μL)；PCR产物5μL；rTaq 0.5μL；Cy3-dUTP 0.5

[0228]反应参数为：95℃5min；95℃40s，60℃40s，72℃45s，30个循环；72℃5min。[0229]得到待杂交样本。[0230]二、芯片杂交：

[0231]将上述一获得的待杂交样本放在50℃烘箱烘干，加入20μL杂交液，混匀，加到芯片的一个阵上，盖上玻片，装到杂交仓中，放入水浴锅，42℃，杂交16h，得到杂交产物。[0232]三、芯片检测

[0233]将上述杂交产物按照实施例2中的步骤进行扫描，结果如图5所示，21669：小肠耶

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尔森氏菌ATCC21669对应检测到了161号ail和166号yst基因特异探针信号；21617：副溶血弧菌ATCC21617对应检测到了165号toxR基因特异探针信号；33560：空肠弯曲菌ATCC33560对应检测到了164号hip基因特异探针信号；vbO:非O1群霍乱弧菌vbO对应检测到了163号ompW基因特异探针信号；33559:结肠弯曲菌ATCC33559对应检测到了162号asp基因特异探针信号。

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