茉莉酸甲酯对丹参茎叶丹酚酸和丹酚酸B含量影响
【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果
的论说性文章。论文网为您提供医药论文范文参考,以及论文写作指导和格式排版要求,解决您在论文写作中的难题。 茉莉酸甲酯对丹参茎叶丹酚酸和丹酚酸B含量影响 【摘要】 目的探讨茉莉酸甲酯(methy jasmonat, MJ )对栽培丹参的药效成分影响,并为丹参地上部分的开发利用提供一定的研究依据。方法采用比色法和HPLC法,以丹酚酸和丹酚酸B为检测指标,对茉莉酸甲酯处理的丹参茎叶样品进行检测。结果丹参种苗经茉莉酸甲酯喷施处理后的48
h内,其茎叶中丹酚酸和丹酚酸B含量均高于对
照,在所测试范围5 10-9~5 10-3的浓度中,随浓度的升高而含量增加。结论外施茉莉酸甲酯能促进丹参茎叶中的丹酚酸和丹酚酸B含量的积累,可以考虑在生产中加以应用,并注意今后在丹参的种植及采收中地上部分的利用。 【关键词】 丹参 茉莉酸甲酯 丹酚酸 丹酚酸B
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Abstract:ObjectiveTo study the effect of methyl jasmonate(MJ)on medicine composition of cultivar Salvia miltiorrhiza,and provide some reference for the exploitation and utilization of the leaves and stems in Salvia miltiorrhiza.MethodsThe leaves and stems of Salvia miltiorrhiza were treated with MJ, the contents of salvianolic acid and salvianolic acid B were assayed by the methods of colorimetry and HPLC. ResultsWithin the concentration of 5 10-9~5 10-3g/L, the contents of the salvianolic acid and salvianolic acid B in Salvia miltiorrhiza treated by MJ were higher than those in control, and increased while the concentration of MJ increased.ConclusionThe contents of the salvianolic acid and salvianolic acid B in the leaves and stems of Salvia miltiorrhiza can be promoted by MJ, and utlization in cultivated planting of Salvia miltiorrhiza should be considered. Key words:Salvia miltiorrhiza Bge.; Methyl jasmonate; Salvianolic acid; Salvianolic acid B 丹参Salvia miltiorrhiza Bge.为唇形科植物丹参的干燥根及根茎,其有效成分包括水溶性和脂溶性两大类。脂溶性成分主要是二萜醌类化合物(包括丹参酮、隐丹参酮等),水溶性成分主要为酚酸类化合物[包括丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、咖啡酸、丹酚酸(salvianolic acid A、B 等)]。丹参的水溶性酚酸类化合物,引起了医药学家的极大重视,也由于丹参的传统应用方式为水煎液,近些年来,对于其水溶性酚酸类化合物的研究较多[1,2]。丹酚酸B是目前研究较多的丹酚酸之一,在治疗心血管疾病、慢性肝炎,抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化和改善记忆功能障碍等方面发挥着重要
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作用[3]。最新研究表明,丹参叶中的酚酸类含量与根中相似,有些甚至高于根部[4,5]。茉莉酸甲酯(MJ)是植物响应病原物、害虫等多种环境胁迫的共同信号分子,广泛存在于高等植物体内,并作为新型的植物激素,在调节植物生长发育、光合作用、抗逆反应等方面起着重要的作用,外施到植物体可以达到一定的逆境胁迫和调节效应[6,7]。有报道外源性MJ类化合物能有效刺激植物次生代谢物的生物合成,可引起多种植物次生产物的迅速积累[8]。 目前有利用MJ研究诱导丹参毛状根中的有效成分的积累的报道[8],本研究旨在利用MJ作为诱导子,在丹参的生产中进行田间喷施实验,探索MJ对丹酚酸B的调控机制,以及MJ在丹参生产中的应用及丹参地上部分的进一步合理开发提供研究依据。 1 材料 供试材料为丹参Salvia miltiorrhiza Bge种苗, 购于山东菏泽丹参种植基地,茉莉酸甲酯(MJ)为美国Sigma公司产品。实验地位于广东药学院大学城校区药用植物实验园。 2 方法 2.1
实验设计及处理实验设5个处理:(Ⅰ)对照(丹参喷清水);(Ⅱ)喷施MJ 5 10-
9mol/L;(Ⅲ)喷施MJ 5 10-7mol/L;(Ⅳ)喷施MJ 5 10-5mol/L;(Ⅴ)喷施MJ 5 10-3mol/L。小
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区面积1 m2,4次重复,随机区组实验设计。MJ和清水均在出齐三片复叶时喷施,将配好的各种浓度的MJ溶液用喷壶均匀地喷到对应各组叶片上,以喷满全部叶片为度,喷后立即套上保鲜袋。喷施后48 h取样,取每株苗的全部小叶片,将叶置60℃烘干箱烘6 h,取出粉碎,过50目筛后用棕色广口瓶保存。 2.2 丹参总酚酸含量测定 2.2.1
原儿茶醛标准曲线制定精密称取原儿茶醛8.50
mg,加水溶解并定容至20
ml(425 g/ml),作为对照品溶液。分别精密吸取原儿茶醛对照品液0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 ml加水至2 ml,分别加0.5%NaNO2 5.0 ml放置5 min,加入10%Al(NO3)3 0.5 ml,放置5 min,加入1 mol/L NaOH液5.0ml,放置10 min后,以显色剂为空白,在500
nm处测得吸光值。以浓度X为横坐标,吸光值Y为纵坐标,方程为
Y=0.0014X+0.000 4,r=0.999 1,线性范围为26~130 g/ml。 2.2.2 总酚酸的测定精密称取样品粉末0.2 g,置50 ml容量瓶中,加2%盐酸水溶液约12 ml,浸泡15 h,加酸水补足量,振摇10 min,经干燥滤纸过滤,弃去初滤液,精密量取续滤液5 ml,置分液漏斗中,加NaCl 0.5 g,醋酸乙酯萃取3次,5 ml/次,水浴蒸干,残留物以无水乙醇溶解并定量转移到10 ml容量瓶中,再用无水乙醇稀释至刻度,摇匀,经干燥滤纸过滤,弃去初滤液,精密量取滤液1 ml按原儿茶醛标准曲线测定的方法测定吸光度,计算生药水溶性总酚酸的含量。 4
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【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果
的论说性文章。论文网为您提供医药论文范文参考,以及论文写作指导和格式排版要求,解决您在论文写作中的难题。 花椒多酚类化合物抗自由基抗氧化损伤研究 作者:凌智群,万杰,胡苗苗,岑娇,魏萍 【摘要】 目的观察花椒多酚类化合物总提取物(ZPPC)对活性氧自由基 OH、O2- 和肝脂质过氧化损伤的作用。方法分别利用化学发光法、体外肝匀浆温育Fe2+和H2O2诱导及CCl4肝损伤实验探讨ZPPC对 OH和O2- 的清除作用及检测肝和血浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性以及脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量。结果
ZPPC能有效地清
除活性氧自由基;口服低剂量ZPPC能显著降低CCl4 中毒小鼠血浆MDA,提高SOD活性。结论适量ZPPC具有抗活性氧自由基和脂质过氧化的作用。 5
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【关键词】 花椒 多酚类化合物 自由基 抗氧化损伤 Abstract:ObjectiveTo study the effects of procyanidins extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim. (ZPPC) on active oxygen radicals and lipid peroxidation.Methods(1) The scavenging effects of ZPPC on OH, and O2- were investigated by chemiluminescence method; (2) The contents of malondialdehyde (MDA) in liver homogenates incubated with Fe2+ and H2O2 in vitro was determined; (3) The mice were treated with a single intragastric feeding of 5% CCl4 soya bean oil solution (10 ml/kgbw) after seven days supplementation of ZPPC [200,400,800 mg/(kg bw d)]. The activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of MDA in liver and plasma of CCl4 toxic mice were determined.ResultsIn vitro, ZPPC 388.9 mg/L and 431.22 mg/L has marked activity on OH in Fenton systems and O2-. produced in xanthine/xanthine oxidase respectively, and could significantly decrease the contents of liver MDA. In vivo, ZPPC [200,400 mg/(kg bw d)] evidently reduced the content of MDA and increased the activity of SOD. ConclusionIt suggests that ZPPC may be used as an antioxidant and might effectively protect liver from the injury due to lipid peroxidation. Key words: Zanthoxylum bungeanum Maxim.; Polyphenols; Free radicals 花椒为芸香科植物青椒Zanthoxylum schinifolium Sieb. Et Zucc.或花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.的干燥成熟果皮,味辛,性温,小毒,具有 温中止痛,驱虫,外用燥湿,杀虫止痒 的功效[1],其主要化学成分有生物碱、酰胺、木脂素、香豆素、挥发油
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和脂肪酸等,而花椒多酚类化合物的相关研究报道较少。多酚类化合物是广泛存在于植物界的一类具有多种生理功能的活性物质, 它不仅具有很强的清除自由基能力, 还可以通过抑制氧化酶和络合过渡金属离子等方式起到抗氧化作用。本文以四川汉源花椒为研究对象,研究花椒总多酚类化合物的抗氧化活性,旨在充分挖掘利用该资源。 1 材料 1.1 动物SD大鼠,雄性180~200 g;昆明种小鼠,雄性18~20 g,成都中医药大学实验动物中心提供。 1.2 样品制备花椒购自四川九襄。粉碎,丙酮-水溶液(7∶3)浸提,减压除去浸提液中丙酮,然后过滤残留水液,将滤液经醋酸乙酯萃取分离,脱水干燥,得到花椒多酚类化合物总粗提取物(ZPPC),得率为0.033%。ZPPC为黄棕色粉末,实验前用生理盐水配成所需浓度。 1.3
药品黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、3-氨基邻苯二甲酰肼购于Sigma公司,其余化学试
剂均为AR级。超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化产物(MDA)测试盒:南京建成生物工程研究所提供。 2 方法 7
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2.1 总酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu法测定。准确吸取100 l的提取物, 加入200 l稀释1倍的酚试剂, 混匀, 再加入10﹪ 2 ml Na2CO3溶液, 用蒸馏水定容至5 ml, 摇匀, 室温避光反应40 min,4 000 r/min离心10 min., 上清液在760 nm 处测吸光度。结果以100 g 提取物中含有相当没食子酸的克数表示。 2.2 羟基自由基( OH)的产生和清除吸取一定量的ZPPC溶液, 50 l 60 mmol/L 2-脱氧核糖, 100 l 1mmol/L EDTA-FeCl3, 100 l 1 mmol/L Vc 和100 l 1 mmol/L H2O2, 用200 mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲溶液定容至 1 ml, 置于37℃水浴锅中反应 1 h, 取出后分别加10﹪三氯乙酸溶液和1﹪ 硫代巴比妥酸, 在80℃水浴中反应15 min, 冷却后在532 nm 下测定其吸光度。 羟基自由基清除率(%)=(1-A样品/A对照) 100﹪ A样品:样品管的吸光值; A对照:对照管的吸光值 8
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2.3 超氧阴离子(O2- )的产生和清除用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生O2- ,然后加入Luminol试剂[2]和样品,在WDD-1型发光测试仪上测试反应1min时的发光值,以蒸馏水为空白对照。 2.4 体外给药对大鼠肝匀浆MDA含量的测定参照文献方法[3],每支试管加10% 大鼠肝匀浆0.2 ml,给药组每管分别加不同浓度的ZPPC,使其终浓度分别为:4,8,16 g/L,对照组加等体积生理盐水,分别加诱导试液FeSO4(5 mmol/L) 0.1 ml,H2O2(10 mmol/L) 0.1 ml,空白对照组加0.1 ml生理盐水,37% 温育24 h,置冰水中冷却后TBA比色法[4]测MDA含量。 2.5 急性肝损伤实验昆明种小鼠50只,随机分为5组:正常对照组、CCl4中毒组、ZPPC3个不同剂量组[每组小鼠分别灌胃200,400,800 mg/(kg d)]。对照组给等体积生理盐水,连续7 d。末次灌胃后24 h,除正常对照组给等体积豆油外,其余各组一次灌胃5% CCl4油溶液10 ml/kg 体重,灌胃后不久,小鼠逐渐表现出中毒症状:行动迟缓,全身蜷缩懒动,毛发竖立。24 h后摘眼球取血,肝素抗凝,然后颈椎脱臼法处死小鼠,摘取肝脏,制成10%匀浆,分别测定MDA含量、SOD酶活性。 2.6 数据处理以抑制O2- 的发光强度一半的浓度(IC50)为标准,判断ZPPC的有效性和效价;实验数据表示为 s,应用SPSS11.0统计软件,采用t检验和方差分析进行统计学处理。 9
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3 结果 3.1 ZPPC和维生素C对 OH的清除作用结果见表1。羟基自由基已广泛用于测定植物提取物的抗氧化活性领域,羟基自由基是已知的最强的氧化剂,它比高锰酸钾和重铬酸钾的氧化性还强,具有极强的反应性,寿命极短,在很多缓冲溶液中,只要一产生,就会同缓冲溶液反应。它几乎可以攻击所有的邻近细胞,同细胞中的所有成分发生反应,对人体的危害最大。 从表1中可以看出,ZPPC的有效半数清除浓度为388.9 mg/L,与4.1 mg/L的VC的清除能力相当,且在一定浓度(20~800 g/ml)范围内,ZPPC随着浓度的增加,其清除Fenton体系羟基中自由基的能力亦增强,呈现出一定的量效关系。表1 ZPPC对Fenton体系羟基自由基( OH)清除作用的影响(略) 3.2 ZPPC对O2- 的清除作用结果见表2。表2 ZPPC对超氧阴离子自由基(O2- )的清除作用(略) 生物体内主要的活性氧有超氧阴离子自由基(O2- )、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基( OH)、烷氧基自由基等。超氧阴离子自由基是体内链式反应最早生产的自由基,其可被进一步还原,是线粒体生成有害活性氧的源头,一旦清除了超氧阴离子,便可以从根本上预防体内过多的羟基自由基和其它活性氧自由基,从而达到抗氧化损伤的目的。表2显示,ZPPC的有效半数清除浓度为431.22 mg/L,与0.87 mg/L的维生素C(VC)的
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清除能力相当,而且ZPPC对体系中产生的O2- 的抑制率与ZPPC的浓度呈直线正相关,即在一定范围内,随着ZPPC浓度的提高,其抑制率增强。 3.3 体外ZPPC对大鼠肝匀浆MDA含量的影响结果见表3。肝脏具有丰富的酶性抗氧化剂,而且也是一个具有微粒体和线粒体系统的在正常代谢过程中能产生活性氧自由基的器官。当Fe2+与过氧化氢等活性氧反应生成毒性更大的羟基自由基, 引发生物膜发生脂质过氧化反应,即自由基产生和抗氧化能力的平衡被打破时,就有可能发生组织损伤。而抗氧化剂与Fe2+发生络合反应后, 降低了介质中Fe2+的有效浓度, 从而减轻自由基对生物膜的氧化损伤作用。 由表3可见,ZPPC对Fe2+和H2O2诱发的MDA值均有显著的抑制作用,且呈剂量依赖性。由于已知MDA含量的高低在一定程度上反映出膜脂质过氧化程度的强弱,提示ZPPC可抑制肝细胞膜脂质过氧化,推测其作用机理与ZPPC对活性氧自由基的清除作用及其强还原性及螯合金属离子的特性有关。表3 体外给药对Fe2+、H2O2引起大鼠肝匀浆MDA生成的影响(略)与空白对照组比较,aP 0.01;n=10 3.4 ZPPC对CCl4中毒小鼠肝和血浆SOD酶活性和MDA含量的影响结果见表4。表4 ZPPC对CCl4诱导肝损伤小鼠肝脏、血浆SOD 活性的影响(略)与正常对照组比较,aP 0.01;与CCl4 模型组比较b P 0.05,cP 0.01 ;n=10表5 ZPPC对CCl4诱导肝损伤小鼠肝脏、血浆MDA 生成的影响(略)与正常对照组比较,aP 0.01 ;与CCl4 模型组比较,bP 0.05, cP 0.01 11
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作为一种选择性肝脏毒物,CCl4具用很强的诱导肝脏脂质过氧化作用[5,6],由于在体内时对肝亲和力大,通过肝微粒体中的细胞色素P-450代谢激活后生成三氯甲基[ CCl3]等自由基,诱发肝细胞膜发生脂质过氧化,是导致肝细胞损伤的一个重要因素。表4表明,CCl4组小鼠肝和血浆SOD酶活性比正常对照组显著降低(P 0.01),而口服ZPPC中、低剂量[200,400mg/(kg bw d)]可显著抑制CCl4引起的小鼠肝和血浆SOD酶活性的下降(P 0.01)。但高剂量组[800 mg/(kg bw d)]无效;表5结果显示,CCl4中毒组小鼠肝脏和血浆MDA含量显著升高(P 0.01)。口服ZPPC能在一定程度上防止CCl4的损伤,中、低剂量组小鼠肝和血浆MDA含量较CCl4组显著降低(P 0.01),同样高剂量(800 mg/kg)也无效。提示ZPPC作为多酚类化合物,在动物体内的抗氧化活性规律与体外抗自由基作用的规律是一致的:在一定浓度范围内,ZPPC的抗氧化活性随着浓度的升高而降低。 4 结论 本实验采用体外体外抗氧化实验模型,研究了从花椒中提取出的总多酚类化合物的清除 OH 和O2- 、抗Fe2+和H2O2诱发抑制脂质体氧化能力和体内抗CCl4诱导肝脏脂质过氧化能力以评价其抗氧化性。结果表明,从花椒中提取出的总多酚类化合物有较强的还原能力,能够抑制脂质体过氧化,有清除 OH,O2- 自由基的活性,而且在不同体系中,花椒总多酚类化合物的抗氧化活性与其浓度之间均有一定的量效关系,为进一步研究奠定了基础。 12
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2.3.3 供试品溶液的制备取丹参样品粉末约0.25 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇溶液25 ml,密塞,称定重量,加热回流1 h,放冷,再称定重量,用75%甲醇溶液补充丢失的溶剂量,摇匀,过滤,取滤液,即得。 2.3.4
线性关系考察精密称取丹酚酸B对照品溶液,分别精密吸取2,4,8,10,
12,14 l分别进样,测定峰面积,以峰面积Y对进样量X进行线性回归,得回归方程Y=23 602X-3 522.4,r=0.999 9;表明丹酚酸B进样量在0.604~3.624 g范围内与峰面积成良好的线性关系。 2.3.5
精密度实验取样品溶液20
l,重复进样6次。结果丹酚酸B峰面积
RSD=1.25%,重复性良好。 2.3.6 稳定性实验取样品溶液10 l,分别在制备后0,2,4,8,12,24 h测定,结果丹酚酸B峰面积RSD=1.58%,表明24h内溶液稳定。 2.3.7 回收率实验平行在6份样品溶液中加入丹酚酸B标准品溶液1.7 ml,依法操作,测定,结果平均回收率为98.0%,RSD=1.0%。 15
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丹酚酸B的HPLC图见图1。 3 结果 3.1
不同浓度MJ对丹参地上部分水溶性总酚酸含量的影响实验结果(见表1)显示,
在所测试的范围内,丹参地上部分茎、叶的水溶性总酚酸含量随茉莉酸甲酯浓度的升高而增加,叶中的水溶性总酚酸含量增加的程度较茎中增加的大,如茉莉酸甲酯浓度为5 10-5mol/L时,叶的总酚酸含量较对照增加了62%,茎中总酚酸含量较对照增加了36%;茉莉酸甲酯浓度在5 10-3mol/L条件下,叶的总酚酸含量较对照增加了100%,茎中总酚酸含量较对照增加了48%。表1 不同浓度茉莉酸甲酯对丹参茎叶中总酚酸含量的影响(略) 3.2
不同浓度MJ对丹参地上部分丹酚酸B含量的影响实验结果(图2~6,表2)显
示,在测试的范围内,丹参地上部分茎、叶的丹酚酸B含量随MJ浓度的升高而增加,其中叶的丹酚酸B含量增加的程度较茎的大,如茉莉酸甲酯浓度为5
10-5mol/L
时,叶的丹酚酸B含量较对照增加了83%,茎中丹酚酸B含量较对照增加了29%;MJ浓度在5 10-3 mol/L条件下,叶的丹酚酸B含量较对照增加了117%,茎中丹酚酸B含量较对照增加了57%。表2 (略) 3.3 MJ在不同时间内对丹参地上部分水溶性总酚酸含量的影响以5 10-5mol/L的MJ
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茉莉酸甲酯对丹参茎叶中丹酚酸B含量影响的测定结果
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喷施丹参叶面,在不同时间检测叶和茎中的总酚酸含量,结果见图7。实验结果表明,随处理时间的延长,丹参叶和茎中的总酚酸含量增加,其中叶中的总酚酸含量增加的幅度较茎的大。在处理72 h和120 h后,丹参叶中总酚酸含量分别较对照增加了92%和108%,茎中总酚酸含量分别较对照增加了30%和44%。 3.4 MJ在不同时间内对丹参地上部分丹酚酸B含量的影响以5 10-5mol/L的MJ喷施丹参叶面,在不同时间分别检测茎叶中的丹酚酸B含量。结果见图8。实验结果显示,随处理时间的延长,丹参叶和茎中的丹酚酸B含量增加,其中叶中的丹酚酸B含量增加的幅度也较茎的大。在处理72 h和120 h后,丹参叶中丹酚酸B含量分别较对照增加了117%和167%,茎中丹酚酸B含量分别较对照增加了57%和86%。 4 讨论 MJ对植物次生产物积累的作用与其生理功能有关,外施MJ可以达到逆境的效应,MJ也是植物细胞响应多种环境胁迫的共同信号分子[7~10]。本项研究表明,利用MJ喷施丹参植株叶面,对丹参地上部分总酚酸和丹酚酸B的含量积累都有一定的促进作用,促进作用随MJ浓度的增加和时间的延续而增强。 药用植物的药效成分大多是次生代谢产物,植物次生产物的积累是与其生境密切相关的,一些逆境有利于次生产物的积累[11],从生态学的角度分析,许多次生产物也是植物防御逆境的植保素类物质。研究表明,不同产地的丹参中的脂溶性和水溶性成分
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的含量均有显著差异[12],表明丹参的次生产物含量受环境的调控性。在一些研究中利用MJ作为诱导子诱导培养的细胞积累目的产物,如:MJ能够诱导培养的肉苁蓉细胞中苯乙醇苷、红豆杉细胞中的紫杉醇等物质含量的增加, 对于培养的丹参毛状根中丹参酮含量的积累也有促进作用 [8,13,14]。MJ可以从植物的气孔进入植物体, 在细胞质中被酯酶水解为茉莉酸等小分子,
实现防御信号的远距离传导,并能在植物间进行信
号交流,在植物组织的液相和气相中自由的快速移动。本研究结果显示,MJ对丹参叶的作用效应较茎的显著,可能由于MJ直接喷施到叶有关,而在茎中存在距离效应和浓度效应,相关机制需进一步研究。 丹参通常以根入药,
本项研究检测了丹参茎叶中水溶性总酚酸和丹酚酸B的含量均
较高,未被MJ处理的条件下,叶的丹酚酸B含量为0.63%,茎的丹酚酸B含量为0.66%;经MJ处理后,茎叶的丹酚酸B含量都有不同程度的提高,MJ在5 10-9~5 10-3的浓度范围内, 叶的丹酚酸B含量较对照增加了30.7%~117%,茎中丹酚酸B含量较对照增加了3%~57%,对于外施MJ对丹参根中主要药效成分的影响,将另作报道。因此,今后有望考虑MJ在丹参生产中的应用问题,在丹参的种植及采收中,应注意地上部分的利用,同时有必要深入研究MJ促进丹酚酸等药效成分积累的机制。 【参考文献】 tips:感谢大家的阅读,本文由我司收集整编。仅供参阅! 18
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