高温应激对克氏原螯虾免疫酶活性及抗WSSV感染的影响

Mar. 2019

高温应激对克氏原螯虾免疫酶活性及

抗感染的影响

WSSV

徐

进

1，卢建超2

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉430223; 2.华中农业大学水产学院，武汉430070)

魏开金

\\

摘要：为探明高温应激对克氏原螯虾（6$cam'ar#c—$()抗病力的影响，分别采用30 r和35 r水温进行高温 应激试验，应激前和应激后3% 6、12% 24和48 h分别采集血淋巴样本，测定总超氧化物歧化酶（T-SOD)、多酚 氧化酶(PPO)、溶菌酶(LYZ)、酸性磷酸酶（9CP)以及碱性磷酸酶（9LP)等免疫相关酶类指标。并在上述高温应 激下开展白斑综合征病毒（WSSV)人工感染实验，同时设置25 r为阳性和阴性对照组，于感染后3、6、12、 24、48、72 h取鳃组织定量测定WSSV在组织中的载量，同时记录克氏原螯虾的发病和死亡情况，统计累积死 亡率。结果显示，克氏原螯虾血淋巴中的T-SOD与LWZ含量在高温应激后都出现了显著性降低，而PPO、ACP 和ALP的变化差异不大。在35 r饲养条件下，WSSV在克氏原螯虾体内的增殖受到抑制，实验虾发病慢，累积 死亡率相对较低，但在30 r饲养条件下，WSSV在克氏原螯虾体内的增殖较常温(25 r)下更活跃，发病和死 亡更快。结果表明，高温应激能导致克氏原螯虾机体非特异性免疫力降低，30 r时能加快克氏原螯虾感染 WSSV的发病进程，而35r时因病毒复制被抑制而导致疾病的发展受阻。关键词：克氏原螯虾（6rocam'ar#c—$();高温应激；非特异性免疫；WSSV中图分类号：S966. 12 文献标识码： 文章编号：1000X907-(2019)02-0107-06

Effects of hightemperature stress onimmunoenzyme activities

and anti-WSSV infection of Procambarus clarkia

Jin1，WEI Kai-jin1，LUJian-chao2

(1. Yangtze River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuhan 430223，China ；

2. College of Fisheries，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070, China)

XU

of some immune-related enzymes in hemolymph of Procambarus clarkia a

spot syndrome virus ( WSSV) infection were evaluated to reveal the effect of high temperature stress on the disease resist­ance of the crayfish. The high temperature stress ( HTS) experiment was carried out at tlie temperature of 30 and 35 r，re­spectively. The hemolymph samples were sampled before stress and at 3，6，12，24，48 h which were used for T-SOD，PPO，LWZ，9CP，ALP testing. Meanwhile，WSSV artificial infection experiment was carried out under HTS，taking 25 r as the positive and negative infection group，respectively. The gill tissue was sampled at 3，6，12，24，48 h and 72 h PTS for the quantitative analysis of the viral load，and the mortalishowed that，T-SODand LYZ decreased significantly after HTS，while the variety of PPO，ACP and ALP was not signifi­cantly changed. The propagation of WSSV in P. clarkia was inhibited at 35 r，the disease developed sa relevant lowdeath rate. The propagation activity of WSSVat 30 r was higher than that at 25 r，and the infected cray­fish dead faster. It revealed that，HTS could decrease the nonspecific immunity of P. clarkid. The process of WSSV infec­tion was accelerated at 30 r，while it was stayed because of the inhibition of viral replication aKey words： Procambarus clarkia； high temperature stress，nonspecific immunity，WSSV

克氏原螯虾（Prcambarus clrk)俗称“小龙

收稿日期：2018-09-19;修订日期：2018-11-26

资助项目：中国水产科学研究院基本科研业务费资助(2018HY-ZD04)第一作者简介：徐进（1982 -通讯作者：魏开金。E-mail:

)，博士，副研究员，主要从事水产健康养殖研究。E-mail:

Abstract ： The activity

虾”，是目前中国最重要的淡水养殖虾类。据统

xuj+in@yfi ac. cn

weikj@yfi.ac.cn

108

淡水渔业2019 年

计，2017年全国小龙虾养殖面积达8 X 10' hm2, 总产量近113万t,全社会经济总产值约2 685亿 元，比2016年增长83. 15%[1]。急剧增长的养殖 规模背后，随之而来的是日益严重的病害问题[2]。 特别是在高温季节，病害问题尤为突出。前期研究 显示[3]，30 r和35 r的高温能引起克氏原螯虾机 体发生应激反应，并激活机体的抗氧化系统以降低 应激造成的氧化损伤。本实验进一步探讨了高温应 激对克氏原螯虾非特异性免疫酶活性的影响，并定 30和25 r组，每组50尾，25 r暂养一周后进行 人工感染实验。实验前将各组的水温升至相应的温

度并持续充氧，保证溶氧不低于5 mg/L。实验虾 于腹部肌肉处每尾注射50 #L病毒悬液(含109病毒 拷贝），同时放入相应的试验组内进行饲养，实验 期间不投食，不换水。每个实验组分别于感染后 3、6、12、24、48、72 h随机取3尾虾，采集鳃组 织进行病毒定量检测。WSSV的实时荧光定量PCR 检测方法参照文献[6]进行。

量检测了高温应激下白斑综合征病毒（WSSV)在体 内的增殖活力以评价高温应激对机体抗WSSV感染 的影响，以期为预防克氏原螯虾白斑综合征提供科 学依据。

1

材料与方法

1.1试验克氏原螯虾及病毒

试验用健康克氏原螯虾为捕自武汉市梁子湖的 野生克氏原螯虾，经过巢式PCR检测[&，5]确定未感 染WSSV病毒。试验前于25 r暂养1周，挑选活 力强、无病无伤、规格基本一致（体重（30 ±5) g) 的克氏原螯虾用于试验。养殖用水为曝气3 d以上 的自来水，每日换水一次，暂养期间按虾体重的

5k左右投喂商品虾料。人工感染用的病毒悬液为

实验室保存的WSSV阳性样本所制备，使用实时荧 光定量PCR技术测定其浓度，-80 r保存待用。

1.2

高温应激对血淋巴液中免疫酶类的影响

取上述规格基本一致的健康克氏原螯虾，分别

由25 r直接放入30 r和35 r的控温水箱中进行 高温应激试验。每个温度设置1组平行组，每组 50尾克氏原螯虾，控温水箱的规格为70 cm X 50

Cmx40Cm，高温应激实验持续48h，实验期间持

续充氧，并减少人为干扰，避免额外应激。

每组分别于应激前（0h)以及应激后3、6、

12、24、48 h等时间节点各取3尾虾，将虾迅速捞 起并于围心腔抽取0. 5 mL血淋巴液。血淋巴液用 同等体积的5k肝素钠抗凝，并随后于4 r、3 000 &离心10 mG，留取上清于-80 r保存待测。血淋 巴液中的总超氧化物歧化酶(T-SOD)、多酚氧化酶 (PPO)、溶菌酶(LYZ)、酸性磷酸酶(ACP)均采用 检测试剂盒测定，试剂盒为南京建成生物工程研究 所产品，碱性磷酸酶(ALP)用希森美康全自动生化 分析仪(chemix-800 )测定。

1.3高温应激对WSSV在体内复制的影响

人工感染实验分为3个感染实验组，即35、

1.4高温应激下人工感染的累积死亡率测定人工感染实验同上，每个实验组同时设置阴性 对照，阴性对照组每尾注射50 #LPBS。持续观察 记录克氏原螯虾发病和死亡情况，统计累积死 亡率。

1.5数据统计与分析

数据用SPSS 12.0软件进行单因素方差分析 (one-way ANOVA)和DUNCAN多重比较，所有结 果均以平均值±标准差来表示，6 < 0. 05表示差异显著。

2

结果与分析

2.1

高温应激对克氏原螯虾血淋巴免疫酶类的 影响

在30 r和35 r的高温应激下，随着时间的延

长，克氏原螯虾血淋巴液中的T-SOD、PPO、LYZ、

ACP和ALP均有不同程度的变化(见表1，图1)。

在30 r温度下，克氏原螯虾血淋巴液中的T-

SOD在应激后3 h出现上升并维持至12 h，随后开

始降低，24 h降低至应激前水平，且继续降低48 h 后与应激前差异显著。35°C下，T-SOD也在3h后 出现上升，其含量比30 r组略高，3 h后出现下 降，48 hT-SOD含量比应激前水平略低，但差异 不显著。30 r温度应激下，PPO的含量在应激后

24 h内变化不明显，之后略微升高；35 r应激下，

PPO含量在0~6h内略微升高（差异不显著），之 后显著下降，至24 h达到最低点，较应激前差异 显著。l

yz

含量在30 r和35 r高温应激后都出现

显著下降，24 h后下降速度变缓，35 r组比30 r 组含量更低。35 r温度应激后ACP的含量变化不 明显。30 r应激后ACP含量显著下降，3 h后变 化不明显。ALP含量在35 r和30 r高温应激后先 出现下降，3 h(30 r)和6 h(35 r)后出现回 升，但与应激前水平相比变化不显著。总体上看， T-SOD与LYZ含量在高温应激后都出现了显著性

第！期徐进等'高温应激对克氏原螯虾免疫酶活性及抗4

SSV感染的影响

109

降低，PPO、ACP和ALP的变化差异不大。

表1高温应激对克氏原螯虾血淋巴免疫酶类的影响

Tab. 1 Effects of high temperature stresses on the immune parameters in the hemolymph of :

指标

T-SOD/(U/mL)

应激

温度/〇C35303530353035303530

应激时间/h

0

3117.2±3.3a113.9 ±4. 3a92.4±7. 8ab ±2.5b

61224

112. 3 ±0.5abc110.0 ±2. 0a

48106.3 ±6. 2c101.2±4.2b83.2±4.2bc104±7. 8a

110.0±1.7bc110.0±1.7a88.4±1.9ab88.4±1.9b

114. 8 ±0.5ab113. 6 ±2.5a96. 8 ±5.4a

88. 8 ±9. 1b

110.2 ±2. 9bc113. 3 ±1.4a82. 4 ± 6. 0bc87.2 ±1.5b

PPO/(U/mL)

75.2 ±5. 1c.4±4.2b

LYZ/(U/mL)

2b235.3 ±23. 376.5 ±23. 5a313.7 ±27. 5c149.0±27.2d117.7 ±23. 5d109. 8 ±35. 9d ±.3ab266. ±27. 2c376.5 ±23. 5a345. 17 ± 67. 9bc219. 6 ±67. 9c203.9 ±35. 9c196. 11.22 ±0. 17a1.22±0. 17b

22.0±2.0ab22.0±2. 0ab

ACP/(U/100mL)

1. 17 ±0. 18a0. 87 ±0. 20a18.7 ±3. 1ab18.0±2. 0b

1. 15 ±0. 14a0. 82±0. 14a18.0±2.0b21.3 ±1.2ab

1.06 ±0. 19a

0. 80 ±0. 11a

1.02 ±0.23a

0. 84±0. 16a

1.06 ±0. 11a0.73 ±0.03a23. 3 ±1.2a20.7 ±1.2ab

ALP/(U/L)

20.7 ±4. 2ab20.0±4.0ab

23.3 ±1.2a24.0±2.0a

注'表中数值为平均数±标准差（0 =6)。同一行数据右上角的不同字母表示DUNCAN多重比较下的差异显著(6 <0. 05)

虾体内的增殖活力。结果显示（如图2)，在35 °C 下，病毒增殖趋势不明显（在30 C下，病毒增殖

活跃，感染后3 h变化不明显，但在6至24 h出现 显著增长，单位组织中的病毒含量增加1 000多 倍，随后增长趋势趋缓；同样在25 C下，病毒增 殖活跃，感染后3 h单位组织中的病毒含量比30

C组的略高，但之后一直低于30 C组。综上所述，

在35 C饲养条件下，WSSV在克氏原螯虾体内的 增殖受到抑制，但在30 C饲养条件下，WSSV在 克氏原螯虾体内的增殖较常温(25 °C)下更活跃。

■35 °C感染组■30°C感染组国25 °C感染组

图1高温应激后克氏原螯虾血淋巴免疫酶类的变化

Fig. 1 Varieties of the immune-related enzymes inhemolymph of 6 clarkia post high temperature stress

0 3

6 12 24

病毒感染后时间/h

48 72

2.2高温应激下WSSV在克氏原螯虾体内增殖 活力

测定了在！5、30和35°C下WSSV在克氏原螯

图2克氏原螯虾在高温应激下感染4SSV

后鳃组织中的病毒载量

Fig. 2 Viral load in gill tissue of 6 clarkia post WSSV infection under high temperature stress

110

淡水渔业2019 年

2. 3高温应激下克氏原螯虾对4

SSV的抵抗力

续表

有的生物分子，引起蛋白变性、脂类过氧化、DNA 突变和酶失活等[9]。有研究表明，免疫细胞对氧 化应激非常敏感，因为免疫细胞细胞膜含有高浓 度、对过氧化反应高度敏感的不饱和脂肪酸，因此

免疫细胞容易受到过量）0S的损伤，进而影响免 疫系统功能[10]。因此，过多的）0S若不能及时清 除，最终可导致机体的抗病能力下降甚至死亡[11]。 高温应激导致克氏原螯虾T-S0D显著下降，必然 测定了克氏原螯虾在25、30和35 °C下人工感

染WSSV的累积死亡率，以评估高温应激下克氏原 螯虾对4SSV的抵抗力。结果显示（图3)，25 C感 染组在感染2 d后累积死亡率剧增，感染3 d后累 积死亡率达到90k，感染4 d后全部死亡。30 C 感染组在感染1 d后累积死亡率剧增，3 d后全部 死亡。35 C感染组的累积死亡率增加缓慢，感染4 d后死亡率达到20k，5 d后40k，之后没有出现 更多死亡。25 C阴性对照组未出现发病死亡情况。 可见，25 C感染组和30 C感染组的累积死亡率很 高，但30 C感染组发病更快，病程更短。

1

0o

8o

6o

4o

2o

〇1---1 ------2

------3 -------4 ------5

------6 ------7

--感染后时间/d

图

3

克氏原螯虾在高温应激下感染

WSSV后的累积死亡率

Fig. 3 Cumulative mortality of WSSV infection of

P. clarkia under high temperature stress

3

讨论

应激是生物适应性的一种表现形式，但过度的

应激往往会引发机体正常生理功能的紊乱，导致各 种疾病或亚疾病状况的出现[7]。前期研究结果显 示，30 r和35 r高温能使克氏原螯虾机体产生应 激反应，组织中的丙二醛（MDA)含量迅速升高， 至24 h后达到最高值[3]。MDA是细胞脂质过氧化 的产物，具有很强生物毒性，它可损伤生物膜结 构，改变膜的通透性，从而影响一系列生理生化反 应的正常进行[8]。本研究探讨了高温应激对克氏 原螯虾机体免疫机能的影响。结果显示，在高温应 激下，克氏原螯虾血淋巴中的T-S0D与LYZ含量 在高温应激后都出现了显著性降低。T-S0D是生物 体内具有抗氧化功能的酶，是活性氧自由基的天然 消除剂。活性氧自由基（Reactive Oxygen Species， )0S)是吞噬细胞吞噬病原等异物后引发呼吸爆发 而产生的超氧阴离子（02_)、AO!% 0A及其衍生 物等，它具有很强的氧化活性，能攻击周围几乎所

导致机体的抗氧化能力减弱，使）0S和MDA无法 及时清除，对机体的免疫机能产生负面影响。LYZ 是一种能水解致病菌中粘多糖的碱性酶，它使细胞 壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破 裂内容物逸出而使细菌溶解。LYZ作为非特异性免 疫因子，在虾类抗病原微生物感染中具有重要作 用[12]。高温应激导致克氏原螯虾血淋巴中LYZ的 活性降低，直接导致了其对病原微生物的抵抗力 降低。

4SSV是目前危害虾类和蟹类的主要病毒病 原[13]，也是克氏原螯虾养殖中危害最大的病毒病 原，流行病学资料显示，克氏原螯虾白斑综合征的 发病季节一般在3月底至7月[14]，其中5月份是 发病高峰期[15]。温度通常能对病毒的复制产生较 大影响。Du等[16]研究了高温对4SSV在克氏原螯 虾体内复制的影响，其结果显示，克氏原螯虾在 (32 n 1) C时未见虾死亡，但转至（24 ±1) C时死 亡率达到了 100k，组织中的病毒载量从105cp-

ies/mg10[14]，表明在（32 ± 1) C时4SSV增殖亦受

到抑制。这与本研究的结果基本一致，WSSV在35

C时，的确组织中的病毒载量显著低于25 C和30 C组，感染后72 h的数据显示，35 C组的病毒载

量是25 C和30 C组的1/1 000左右。30 C组和 25 C组在感染WSSV后组织中的病毒载量持续增 加，在感染后3 h，30 C组的病毒载量比25 C组 略低，之后一直高于25 C组。推测可能是由于高

温应激对免疫系统的胁迫效应导致30 C组的病毒 增殖更加活跃。而在35 C时，温度对病毒增殖的 抑制作用更大，尽管免疫系统也受到胁迫，但病毒 的复制效率却不高，导致组织中的病毒载量变化不 大。病毒增殖活力同样反映在发病进程和累积死亡 率上，35 C组的发病进程慢且累积死亡率只有 35k，而30 C组和25 C组的发病进程快，分别在 感染后的第3天和4天累积死亡率达到100k。可 见，高温应激的胁迫效应虽然导致了克氏原螯虾免

第2期

徐进等：高温应激对克氏原螯虾免疫酶活性及抗WSSV感染的影响

111

疫力下降，但同时由于WSSV在35 r时复制受到 抑制而出现发病率和死亡率降低的情况。这一结论 也印证了 WSSV的流行病学特征，即在5% 6月份 时WSSV广泛暴发，而在8月水温最高时却发病 较少。

在克氏原螯虾养殖过程中，每年的高温季节无 法回避，高温应激导致的免疫胁迫效应必然导致克 氏原螯虾对病原的抵抗力降低，使其更容易发病。 虽然本实验揭示了在3〇 r和35 r下wssv对克氏 [6] 张玲，唐小千，绳秀珍，等.实时荧光定量PCR检测克氏

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原螯虾的致死率有差异，但此规律对于其他病原， 特别是细菌病原，并不适用。因此，在疾病高发季 节，还是应该采取一切必要手段来降低和缓解高温 造成的胁迫效应，来降低疾病的发生风险。参考文献：

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