一种铜绿假单胞菌及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103820370 A(43)申请公布日 2014.05.28

(21)申请号 201410083918.7(22)申请日 2014.03.07(83)生物保藏信息

CGMCC No.8390 2013.10.24

(71)申请人江苏农林职业技术学院

地址212400 江苏省镇江市句容江路3

号江苏农林职业技术学院(72)发明人何任红 马爱军

(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所

(普通合伙) 32204

代理人王云(51)Int.Cl.

C02F 3/34(2006.01)C12R 1/385(2006.01)C02F 101/38(2006.01)

C12N 1/20(2006.01)C12N 11/10(2006.01)C12N 11/04(2006.01)

()发明名称

一种铜绿假单胞菌及其应用(57)摘要

本发明公开了一种铜绿假单胞菌，其分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DSP-05，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8390，保藏日期为2013年10月24日。本发明一种铜绿假单胞菌主要应用于降解废水中的毒死蜱，适合在含有毒死蜱的废水处理中推广使用。且采用菌株制备成固定化小球的毒死蜱降解效果更佳，且具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，降低废水处理成本具有重要的意义；本发明一种铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DSP-05培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

权利要求书1页 说明书4页 附图2页权利要求书1页 说明书4页 附图2页

CN 103820370 ACN 103820370 A

权 利 要 求 书

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1.一种铜绿假单胞菌，其分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DSP-05，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.8390，保藏日期为2013年10月24日。

2.权利要求1所述的铜绿假单胞菌在毒死蜱降解中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述铜绿假单胞菌制备成固定化小球后在毒死蜱降解中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，先将固定化小球在毒死蜱生产废水中曝气12h进行活化，活化过程中水温26℃-30℃，曝气量为1.2L/min；然后在温度为26℃-30℃、pH值为6.8-7.2、毒死蜱进水浓度200mg/L、水力停留时间为32h的条件下，每升毒死蜱废水采取185mL的固定化小球来处理。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述铜绿假单胞菌制备成固定化小球的方法包括以下步骤：

（1）用接种环在斜面培养基上挑取少量铜绿假单胞菌菌种接种于LB液体培养基中于30℃，160r/min条件下振荡培养至对数期；

（2）将上述培养好的菌液于8000r/min的条件下离心2min，倒掉上清液，加入相同体积的无菌水，摇匀后于8000r/min的条件下离心2min，重复操作两遍，用相同体积的无菌水悬浮，制成菌体液；

（3）取1mL菌体液与20mL的质量浓度为4%的海藻酸钠溶液于室温混匀，然后用注射器将混合液滴入室温下的质量浓度为3%的CaCl2溶液，于4℃下交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，无菌水洗两遍保存于4℃备用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述步骤（1）中LB培养基的配方为：1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，pH7.0。

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CN 103820370 A

说 明 书

一种铜绿假单胞菌及其应用

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技术领域

[0001]

本发明属于环境及生物技术领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas

aeruginosa)DSP-05及其在毒死蜱生产废水中毒死蜱降解中的应用。

背景技术

[0002] 有机磷农药(Organophosphate pesticides OPs)作为杀虫剂在农业上被广泛应用，是当今农药中的主要类别，长期在国内外大量生产和广泛使用。有机磷农药具有诱变性和致畸性，哺乳动物的神经和免疫系统疾病如疯牛病、克雅病、海湾战争综合症、帕金森综合症等大多与其有关。残留在蔬菜、水果及动物性食品上的有机磷农药由于能够抑制人体内乙酞胆碱酷酶的功能从而对人存在着程度不同的毒性，其中慢性毒性可诱导多发性神经病、中风等，急性中毒可引起人肌肉痉挛、瞳孔收缩、呼吸困难直至死亡。[0003] 毒死蜱是一种高效、广谱有机磷杀虫剂，对害虫具有触杀、胃毒和熏蒸作用，尤其对褐飞虱的防治有非常好的效果。目前它是全球应用最广泛的五种杀虫之一。由于它的生物体内积累作用，会对周围的环境、海中的生物体以及人类产生危害作用。我国农药生产毒死蜱过程中产生的废水中均会含有不同浓度的原药，造成废水难以进行生物降解。在毒死蜱的田间施用过程中，也有很大一部分会散落在农田生态系统中，影响农业生态平衡。微生物降解具有成本低、效率高、无二次污染、生态恢复性好等优点，已在很多方面得到应用，所以筛选出毒死蜱降解菌对于处理毒死蜱生产废水具有重大意义。

发明内容

[0004] 发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种对毒死蜱具有降解作用的铜绿假单胞菌。

[0005] 本发明的第二目的在于提供一种将所述铜绿假单胞菌制备成固定化小球后在毒死蜱降解中的应用。[0006] 技术方案：为了解决上述第一目的，本发明所采用的技术方案为：一种铜绿假单胞菌，其分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DSP-05，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为：CGMCC No.8390，保藏日期为2013年10月24日。[0007] 为了解决上述的第二目的，本发明所采用的技术方案为：所述铜绿假单胞菌制备成固定化小球后在毒死蜱降解中的应用所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制草莓炭疽菌生长中的应用。

[0008] 具体应用为：先将固定化小球在毒死蜱生产废水中曝气12h进行活化，活化过程中水温26℃-30℃，曝气量为1.2L/min；然后在温度为26℃-30℃、pH值为6.8-7.2、毒死蜱进水浓度200mg/L、水力停留时间为32h的条件下，每升毒死蜱废水采取185mL的固定化小球来处理。

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CN 103820370 A[0009]

说 明 书

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更进一步的，将所述铜绿假单胞菌制备成固定化小球的方法包括以下步骤：

[0010] （1）用接种环在斜面培养基上挑取少量铜绿假单胞菌菌种接种于LB液体培养基中于30℃，160r/min条件下振荡培养至对数期；[0011] （2）将上述培养好的菌液于8000r/min的条件下离心2min，倒掉上清液，加入相同体积的无菌水，摇匀后于8000r/min的条件下离心2min，重复操作两遍，用相同体积的无菌水悬浮，制成菌体液；[0012] （3）取1mL菌体液与20mL的质量浓度为4%的海藻酸钠溶液于室温混匀，然后用注射器将混合液滴入室温下的质量浓度为3%的CaCl2溶液，于4℃下交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，无菌水洗两遍保存于4℃备用。[0013] 更进一步的，上述步骤（1）中LB培养基的配方为：1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，pH7.0。[0014] 本发明中所述的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DSP-05的生理活性特征如下：

[0015] 所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DSP-05主要生物学特性为G-，该菌氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖和木糖，产酸不产气，但不分解乳糖和蔗糖。液化明胶、可分解尿素，还原盐为亚盐并产生氮气。[0016] 革兰氏染色表现为阴性；吲哚阴性，利用枸橼酸盐，精氨酸双水解酶阳性；通过BLAST比对该菌株的16SrDNA基因序列，鉴定其为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

[0017] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

[0018] （1）本发明公开的一种铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DSP-05能以毒

死蜱为唯一碳源进行生长；在实验室摇瓶条件下对200mg/L毒死蜱的降解率达93%。本发明还提供了一种使用菌株DSP-05所制备的固定化小球，实验室生物降解实验结果表明，其对200mg/L毒死蜱的降解率达到90%。固定化小球的制备方法具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，可以降解废水中的毒死蜱，适合在含有毒死蜱的废水处理中推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，降低废水处理成本具有重要的意义。[0019] （2）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DSP-05培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。附图说明

图1为本发明菌株DSP-05菌体结晶紫染色照片（1000x）；

[0021] 图2为本发明使用菌株DSP-05制备的固定化小球对毒死蜱降解去除率随时间变化的示意图；

[0022] 图3为本发明使用菌株DSP-05制备的固定化小球对毒死蜱不同进水浓度的降解去除率示意图。

[0020]

具体实施方式

[0023] 下面结合实验例详细阐述本发明铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DSP-05的应用。

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CN 103820370 A[0024]

说 明 书

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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DSP-05菌株的分离和鉴定方法：

[0025] （1）分离：取毒死蜱富集菌液1.0ml，加入9.0mL无菌水中，充分混匀配成10-1的富集液，再吸取1.0mL配好的10-1的富集液加入9.0mL无菌水中，充分混匀配成10-2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1mL涂布于含200mg/L毒死蜱的无机盐固体培养基上（无机盐固体培养基的配方为：1000mL蒸馏水、1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4·7H2O、1.0g NaCl、1.0g(NH4)2SO4，20g琼脂，pH7.0），30℃培养7天；7天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于5mL的LB液体培养基中培养24小时后，于8000r/min的条件下离心2min，倒去上清液，加入5mL的无菌水摇匀，仍于8000r/min的条件下离心2min，按此方法用无菌水洗两遍后，加入5mL无菌水悬浮该菌；吸取1mL该菌液加入100mL毒死蜱浓度为200mg/L的无机盐液体培养基（配方为：1000mL蒸馏水、1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2gMgSO4·7H2O、1.0g NaCl、1.0g(NH4)2SO4，pH7.0）于160r/min，30℃条件下振荡培养3天后，用紫外分光光度法测其降解效果。如图2所示，在实验室摇瓶条件下游离细菌对200mg/L毒死蜱的降解率达90%。[0026] （2）鉴定：将降解效率较高的一株菌株保存，进行后续实验。其菌体革兰氏染色照片（1000x）如图1所示，鉴定为铜绿假单胞菌属（Pseudomonas aeruginosa.p.）；命名为：DSP-05。主要生物学特性为G-，对数生长期菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。该菌氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖和木糖，产酸不产气，但不分解乳糖和蔗糖。液化明胶、可分解尿素，还原盐为亚盐并产生氮气，吲哚阴性，利用枸橼酸盐，精氨酸双水解酶阳性。能以毒死蜱为唯一碳源进行生长。[0027] 将铜绿假单胞菌制备成固定化小球的方法：[0028] （1）用接种环在斜面培养基上挑取少量铜绿假单胞菌菌种接种于LB液体培养基中于30℃，160r/min条件下振荡培养至对数期；[0029] （2）将上述培养好的菌液于8000r/min的条件下离心2min，倒掉上清液，加入相同体积的无菌水，摇匀后于8000r/min的条件下离心2min，重复操作两遍，用相同体积的无菌水悬浮，制成菌体液；[0030] （3）取1mL菌体液与20mL的质量浓度为4%的海藻酸钠溶液于室温混匀，然后用注射器将混合液滴入室温下的质量浓度为3%的CaCl2溶液，于4℃下交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，无菌水洗两遍保存于4℃备用。[0031] 其中上述步骤（1）中LB培养基的配方为：1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，pH7.0。[0032] 实施例1：

[0033] 将固定化小球应用于毒死蜱降解的方法：先将固定化小球在毒死蜱生产废水中曝气12h进行活化，活化过程中水温26℃，曝气量为1.2L/min；然后在温度为26℃、pH值为6.8、毒死蜱进水浓度200mg/L、水力停留时间为32h的条件下，每升毒死蜱废水采取185mL的固定化小球来处理。[0034] 实施例2：

[0035] 先将固定化小球在毒死蜱生产废水中曝气12h进行活化，活化过程中水温30℃，曝气量为1.2L/min；然后在温度为30℃、pH值为7.2、毒死蜱进水浓度200mg/L、水力停留时间为32h的条件下，每升毒死蜱废水采取185mL的固定化小球来处理。

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说 明 书

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实施例3：

[0037] 先将固定化小球在毒死蜱生产废水中曝气12h进行活化，活化过程中水温28℃，曝气量为1.2L/min；然后在温度为28℃、pH值为7.0、毒死蜱进水浓度200mg/L、水力停留时间为32h的条件下，每升毒死蜱废水采取185mL的固定化小球来处理。[0038] 采用上述实施例1-3的方法对于毒死蜱的去除情况如图2所示，毒死蜱的去除率在90%以上，有较好的去除效果。[0039] 如图3所示，对于不同进水浓度的毒死蜱的去除情况，研究表明，毒死蜱的去除率随着进水浓度的升高而降低，当进水的毒死蜱浓度在低于500mg/L的范围内时，毒死蜱都有较高的去除率，可以达到85%以上。

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说 明 书 附 图

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图1

图2

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说 明 书 附 图

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图3

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