Elisa实验报告

Elisa实验报告 实验名称： 酶联免疫吸附剂测定 实验原理： 酶联免疫吸附测定是一种免疫测定技术。测定中，先使抗原吸附在固相载体上，然后加待测的抗体，再用某种酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体的“双抗体夹心”，此时酶仍保有活性，同时标记抗体亦有免疫活性。之后再加入酶的底物，在酶的催化下产生反应并产生有色物，颜色深浅与待测物质的量直接相关。至此，酶的催化放大作用与免疫反应的特异性相完美结合，提高了测定的准确性与灵敏度。 实验材料与试剂： 1．聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 96孔)。 2．酶联免疫检测仪。 3．辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。 4．包被液：0.05 mol/L 碳酸缓冲液（pH 9.6）： Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g， 蒸馏水稀释至100 ml。 5．稀释液（PBS-Tween）： NaCl 8g, KCl 0.2g， KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween-20，0.5ml， 蒸馏水加至1000ml。 6．洗涤液：同稀释液。 7．封闭液：0.5 % （质量分数）BSA（用PBS配制）。 8．邻苯二胺溶液(底物)： 配制： 0.1 mol/L 柠檬酸 (2.1g/100ml), 取6.1ml， 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O (7.163g/100ml), 取6.4ml, 加蒸馏水12.5ml, 取邻苯二胺8mg（溶解）； 临用前加30 % （体积分数）H2O2 40μl。 9．终止液：2 mol/L H2SO4。 实验步骤： １．包被抗原： 用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1~10μg/孔，每孔加200μl, 37 ℃温育30min。 ２．洗涤：倒尽板孔中液体，加200μl洗涤液，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 ３．加封闭液200μl，37 ℃温育30min。 ４．洗涤同2。 ５．加被检血清： 用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200μl。同时作稀释液对照。37 ℃温育30min。 ６．洗涤同2。 ７．加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200μl, 37 ℃温育30min。 ８．洗涤同2。 ９．加底物：邻苯二胺溶液加200μl，室温暗处5min。 １０．加终止液：每孔50μl。 １１．观察结果：用酶联免疫检测仪记录OD490nm读数。 实验结果 数据如下： 血清稀释1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 无1抗 无抗原 倍数 (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) 样本号 (组号) 1.408 1.240 1.211 1.228 1.114 0.810 0.698 0.519 0.374 0.094 1.098 1.357 0.943 0.996 1.019 0.895 0.682 0.415 0.201 0.067 1.494 1.354 1.240 1.334 1.118 0.859 0.667 0.472 0.281 0.083 组平均 1.333 1.317 1.131 1.186 1.084 0.854 0.682 0.419 0.285 0.175 P.S: 紫色数据表示异常 实验讨论： 1无一抗（10）数据值存在异常。理论上应趋近于零。可能是由于受污染所致 实验现象比较清晰，随浓度由浓到稀，颜色由深黄渐变为浅黄。 2线性关系比较明显。但斜率随浓度减小而有所增大。这可能是在使用取液器时有气泡混入，导致实际浓度低于理论上的浓度。 3组号（2）（4）（5）中3个样本数据差别较大，可能是因为配血清时混合不够均匀所致。 这个实验采用了间接法测定，利用酶的催化放大作用提高了检测的灵敏度。作为一名精仪系的学生，这给予我的启示就是，在直接测量精度如果遇到瓶颈时，没有合适的方法提高精度，那么可以考虑寻找一个“中介”，而这个“中介”应该具有“在变量产生微小变化时能放大这种变化，或者用另一种形式体现这种变化”的特性，从而测量变得可行。而该实验中，最终效果就是我们可以直接通过颜色深浅大致看出浓度的不同。这一点很值得思考。 另外由于操作不熟练、不仔细，也带来了一些粗大误差，如无一抗（10）。这是我们实验中应该避免的。