岩大戟内酯B诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的实验研究

岩大戟内酯B诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的实验研究

【摘要】 目的：探讨岩大戟内酯b对mcf-7乳腺癌细胞生长抑制作用及其机理。方法：通过mtt法观察各组细胞增殖能力；采用流式检测技术分析细胞周期；利用annexin v/pi双染检测细胞凋亡情况；电镜观察细胞形态。结果：随着岩大戟内酯b浓度增加对mcf-7的抑瘤率增高；g2/m期细胞减少，s期细胞增多，出现s期阻滞；晚期凋亡和死亡的细胞增加；电镜显示加药后细胞出现核固缩，细胞器空泡变性，凋亡小体形成，甚至出现坏死。结论：岩大戟内酯b对乳腺癌mcf-7细胞生长明显抑制作用，并诱导肿瘤细胞凋亡，为临床开发新药提供理论依据。

【关键词】 岩大戟内酯b； mcf-7； 细胞凋亡

the experiment research on apoptosis of breast cancer cell line mcf-7 treatment with jolkinolide b/xu hui-yu，chen zhi-wei，guo hong-ying，et al.//medical innovation of china， 2012， 9(13):001-003

【abstract】 objective: to investigate the inhibition effects of jolkinolide b on breast cancer cell growth inhibition and its mechanism. methods: author used mtt method to observe the proliferation of mcf-7 cell lines when treat with jolkinolide b; cell cycle was assayed by flow cytometer; annexin v/pi double dye was detected to cell apoptosis; cell morphology was observed by electronic microscopy. results:

the inhibit ratios of mcf-7 cell lines were increased following the drug concentrations of jolkinolide b; the g2 / m period cells reduce， s phase increased the number of cells and increase apoptosis rates， it appears the block of s phase; there were a lot of apoptotic cell and dead cell; many nuclei had become pyknotic by electronic microscopy， organelles empty bubble degeneration， appear apoptotic body， even necrosis after dosing the different concentration of drug. conclusion: jolkinolide b can significantly inhibit the growth of mcf-7 breast cancer cell and induced apoptosis. it is provides the theory for a new drug with the development of clinical therapy.

【key words】 jolkinolide b; mcf-7; apoptosis

first-author’s address: qiqihar medical college， qiqihar 161006， china

狼毒大戟(euphorbia fischeriana steud)含二萜醇类化合物，其化学成分主要包括萜类、鞣质类、甾醇类、挥发油成分等。包括岩大戟内酯(jolkinolide)a、b，狼毒大戟甲、乙素(fischeriana a，b)等，并含(euphol)、皂甙、强心甙、甾醇、酚类及鞣质。散播结，杀虫。外用于淋巴结结核、皮癣；灭蛆。 治疗肺癌、肝癌、胃癌等恶性肿瘤临床疗效显著，未发现对心、肝、肾等造血系统的不良反应[1-2]。不同化学方法提取中药单体成分的研究较为深入

[3-5]。本文仅对岩大戟内酯b对mcf-7乳腺癌细胞抑瘤作用进行探索，为以后临床治疗提供实验依据。 1 材料与方法

1.1 细胞系 mcf-7乳腺癌细胞由北京大学肿瘤医院肿瘤分子生物学研究室惠赠。

1.2 主要仪器和药物 岩大戟内酯b由齐齐哈尔大学帮助提取，主要试剂dmem培养基购自美国gibco公司，胎牛血清购自美国hyclone，二甲基亚砜购自上海凌峰化学试剂有限公司，mtt购自promega公司，其它生化试剂均为分析纯。流式细胞仪(facscan， beckman 公司)，由北京东直门医院检验科测定。 1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 细胞培养均在含5%胎牛血清的dmem培养基中，100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，5% co2 37 ℃条件下培养，隔48 h换液，含0.25%胰酶和0.02% edta消化液隔天消化、传代。 1.3.2 实验分组 本实验共分5组，按岩大戟内酯b浓度递增，分别为对照组(0 μg/ml)(a组)、岩大戟内酯b，10μg/ml组(b组)、20μg/ml组(c组)、40μg/ml组(d组)、80μg/ml组(e组)。进行加药组与不加药组的比较。

1.3.3 mtt法 取对数生长期细胞，在96孔培养板中接种细胞，每孔含2×103个/ml细胞的培养液100 μl，在37 ℃， 5 %co2 的培养箱中培养24 h，实验共分5组，对照组和岩大戟内酯b各不同浓度组，每个浓度均设4个复孔，分别培养24、48、72 h后，培

养中止前4 h，每孔加入20 μl mtt(5 mg/ml)，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，吸掉孔内培养上清液，每孔加入150 μl dmso，避光振荡10 min，以空白组调零，应用酶标仪680以单波570 nm测定各组吸光度值(a)，求每次测定4孔的平均值，实验重复3次。 1.3.4 细胞周期分析 mcf-7乳腺癌细胞药物处理24 h后，常规消化培养细胞成单个细胞悬液(1×106/ml)，预冷1×pbs洗细胞两遍，加入70%预冷乙醇1 ml固定细胞，4 ℃过夜。室温离心收集细胞，以1×pbs洗两遍，以洗去残留的乙醇，用50 g/ml pi 染色液500 l(sigma公司)室温避光染色30 min，上流式细胞仪(facscan，beckman公司)检测细胞周期的变化。

1.3.5 annexin v/pi双染 对数生长期状态良好的mcf-7细胞，种植6×105个细胞，铺五个直径35 mm的小培养皿，用含5%胎牛血清的dmem培养基，同时加入岩大戟内酯b浓度分别为0、10、20、40、80 μg/ml，加药后于24 h，收集5组细胞，按照凋亡检测试剂盒的说明进行染色。并用流式细胞仪进行检测比较各组细胞凋亡的情况。

1.3.6 电镜观察 对数生长期状态良好的mcf-7细胞，种植3×106个细胞，铺五个直径100 mm的培养皿，用含5%胎牛血清的dmem培养基，加入岩大戟内酯b浓度分别为0、10、20、40、80 μg/ml，2.5%的戊二醛固定24 h，1%四氧化铬固定24 h，置丙酮中逐级脱水，环氧树脂包埋，1 μm半薄切片，1% naoh无水乙醇软化1 h，

制备超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电子显微镜观察、拍片。

1.4 统计学处理 采用spss 11.5统计软件进行分析处理，计量资料以(x±s)表示，各组数据先行方差齐性检验， 再进行anova单因素方差分析。均数间差别多重比较的lsd(least significant difference)检验。 2 结果

2.1 岩大戟内酯b分子式(c28h26o4)和分子量(330.42)。 2.2 mtt法检测岩大戟内酯b对mcf-7乳腺癌细胞作用24、48、72 h；作用剂量为0、10、20、40、80 μg/ml；细胞生存数量显示呈时间和剂量依赖性，和a组相比差异有统计学意义(p<0.01)。见表1。

*与a组比较，p<0.01

2.3 岩大戟内酯b对mcf-7细胞周期的影响 g0/g1期细胞无明显变化，g2/m期细胞减少，s期细胞增多，出现明显的ap峰，与a组比较差异有统计学意义(p<0.01)。见表2。 *与a组比较，p<0.01

2.4 岩大戟内酯b对mcf-7细胞凋亡率的影响 经岩大戟内酯b预处理24 h后，mcf-7细胞凋亡率增加，并有剂量依赖关系。见表3。

*与a组比较，p<0.01

2.5 电镜结果分析 对照组：瘤细胞呈条索状排列，核质比例大，

巨核细胞多见， 核异形性强，核内常染色质多，核仁明显。胞质内线粒体显著增生、扩张，嵴模糊、脱颗粒，丰富的粗面内质网囊腔扩张，腔内充满低电子密度的蛋白粒子，核周高尔基复合体发达。药物处理组：异染色质相对增多，胞质内线粒体空泡变性，双层核膜结构清晰，细胞内膜结构完好，核固缩，染色质边集，细胞核形成核带和核突，有新月形或花环状(凋亡小体形成)，甚至出现坏死细胞形态。 3 讨论

狼毒大戟中岩大戟内酯b的含量较高，在0.040%～0.169%之间[6]。本研究中，笔者用mtt、流式细胞术和电镜技术观察了岩大戟内酯b对mcf-7肿瘤细胞生长的影响、细胞周期及细胞凋亡的影响。结果显示，岩大戟内酯b可抑制mcf-7肿瘤细胞的生长，并有时效和量效依赖性。肿瘤的发生、发展和癌变与细胞周期调节失控密切相关。细胞周期的顺利进行和完成依赖于一系列正负调节因子的相互作用，有细胞周期蛋白(cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶 (cyclin-dependent kinases，cdks)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cycin-dependent kinases inhibitor， cki)肿瘤的形成是细胞增殖、凋亡和分化异常的结果。基于细胞分子生物学的现代医学研究表明，细胞周期与细胞癌变已不是两个的事件，肿瘤是一种细胞周期紊乱性疾病[7]。细胞周期蛋白分cyclin a、b、c、d、e、f、g、h、i、k 十大类细胞周期蛋白多数通过在细胞周期时相性地合成与降解，调节对其依赖的蛋白激酶(cdk)活性，从而调

控细胞周期进程。细胞周期是从一代向下一代传递的连续过程，因此是一个不断更新、不断从头开始的过程。整个周期表示为：g1期→s期→g2期→m期。岩大戟内酯b能减少g2/m期细胞，增加s期细胞，说明岩大戟内酯b阻滞肿瘤细胞在s 期细胞，影响其向g2/m期转化，并出现凋亡峰，凋亡率为31.26%。当前研究中发现的细胞周期s期阻滞，这与细胞周期复合体(cyclina1/cdk2/pcna complex)的生成减少与p21cip1表达上调密切相关。cyclina1和cdk2属于正向细胞周期蛋白，pcna是一种酸性核蛋白，与dna合成关系密切，能促进dna聚合酶延伸dna的能力；而p21cip1是细胞周期的负因子，高表达时可阻断正常细胞周期进程；在细胞周期中的dna合成期的cyclina1/cdk2/pcna复合体含量，它是确保细胞从s期顺利进入g2/m的关键因素。annexin v/pi染色表明，岩大戟内酯b使mcf-7细胞晚凋和死亡的细胞增多。电镜观察发现岩大戟内酯b明显促进mcf-7细胞凋亡，核固缩，空泡样变，细胞浆出芽，染色体边集。本研究显示，岩大戟内酯b具有明显的抑瘤作用。有效诱导mcf-7乳腺癌肿瘤细胞凋亡，可能是岩大戟内酯b抗肿瘤作用的机理之一。对于其他抗肿瘤途径，本实验室正在研究。 参考文献

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