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5-生物化学实验指导书

来源：华拓网

生物化学

实验指导书

生物化学教研室 2011、2、1

实验须知实验内容

实验一蛋白质的两性电离和等电点的测定实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳

实验三血清总蛋白测定（双缩脲法、Folin—酚法）实验四 PH与温度对酶活性的影响实验五激活剂和抑制剂对酶活性的影响实验六酶的特异性

实验七琥珀酸脱氢酶活性的抑制实验八分光光度计的使用

实验九血糖的测定（葡萄糖氧化酶法）实验十肝中酮体生成作用实验十一血清胆固醇测定（酶法）实验十二 ALT的测定

实验十三血红蛋白与核黄素的凝胶柱色谱分离实验十四肝组织核酸的提取、分离和鉴定实验十五血清尿素氮的测定实验十六血清胆红素测定

实验十七：总糖的测定---蒽酮比色法实验十八：饥饿与饱食对肝糖元含量的影响实验十九：乳酸脱氢酶活力测定

生物化学实验须知

一、实验目的

1．培养学生科学的思维方法和学习作风，工作能力。

2．学习基础生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。 3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。 4．培养学生的书面及口头表达能力。二、实验的总要求

1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。未预习者不得进实验室。

2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。一切步骤都按正规操作方法进行；样品与试剂勿过量取用；注意力集中，避免差错。

3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观。无论实验成功与失败，都应直接记录在实验报告本中，不得于实验后追记。对于失败的实验，要分析其原因。

4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。

5．注意保持实验室内的整洁。实验用器具、试剂等应排列整齐有序。实验时切勿将试剂、标本溅洒于实验台面、地面及衣物上，如果有溅出应及时处理。实验后应清洗用过的仪器及清理自己的实验场所。实验所用的器材、设备不得随意乱动。实验室内的一切器材物品严禁携出。

6．实验时使用水、电、火、易燃易爆试剂、化学毒剂及传染标本等应注意安全，防止燃烧或爆炸，防止中毒等事故之发生。

7．对师长尊敬，对同学要团结友爱。三、实验报告

实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。实验报告的内容包括下列各项：实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤，实验记录、计算、讨论或小结。实验记录应包括随做随记的原始记录。书写实验报告要字迹工整，语句通顺。书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。

四、组织与分组

1．每一实验室推选一名学生课代表，负责下列工作：①实验报告的收集与分发；②安排清扫值日名单；③反映同学学习情况及对教学工作的意见；④其它临时性的工作。

2．一般每个学生单独进行实验。有的实验要两人一组，由相邻两学生组成固定小组。小组的成员在指导教师的同意下，可作适当的调整。

五、仪器

1．每次实验前，实验者应根据本实验使用的仪器种类与数目，检查分发在实验桌上的各种仪器，如有缺损应于清洗前立即向准备室负责老师补换。实验中如有破损，则必须登记，按学院规定处理。实验后应将完整仪器洗涤清洁，点交管理人员。

2．公用仪器（包括贵重仪器，如分光光度计、电动离心机等）使用时间不宜过长，以免妨碍他人工作。设有使用登记薄的仪器，使用后必须登记，以示负责。对于不熟悉之仪器，应请教师指导，切勿随意乱动。

六、试剂

1．每2~6人合用一份试剂。在一般情况下，使用的试剂应该固定。

2．取试剂瓶塞与量取用具（如吸管或滴管）不应分开，用后应立即放回原处，量取用具应按规定放置。瓶塞与量具一旦弄错，试剂即受损坏、污染，实验就可能失败。

3．标准试剂不应用潮湿之吸管与之直接接触，取出后不得再放入原瓶。七、玻璃仪器的洗涤

一般玻璃仪器用肥皂或去污粉以毛刷洗涤即足以满足要求，洗后应将肥皂或去污粉仔细冲掉，将水倾去后，器壁不挂水珠，视为合格。铬酸洗液仅用于毛刷不能洗净的仪器，切勿滥用普通玻璃仪器之洗涤。使用铬酸洗液时，仪器应干燥；过多的水份将使洗液迅速失效。用过之铬酸洗液须加以保存以反复使用，直至为绿色后方可舍弃；其舍弃法与浓硫酸液相同。用洗液浸洗过的玻璃仪器，应先用自来水冲洗，然后再用蒸馏水或去离子水清洗，清洗时，宜采用“少量多次”原则以节约蒸馏水，同时清洗的效率也高。

八、舍弃物的处理

舍弃物必须依照其性质作适当的处理。以免造成实验材料的浪费，损坏水槽及下水管道，或污染实验环境。

1．所有固体舍弃物（例如用过的滤纸、损坏的软木塞及橡皮物、玻璃渣、火柴梗等）。必须放入废物筒或篓中，切勿丢入水槽中。

2．废硫酸或洗液，应先倾入大量水中，再倒入水槽中，并以大量水冲走。 3．实验完成后的沉淀或混合物，若含有可提取或收回的贵重物品者，不可随意舍弃，应放入教师指定的回收器中。

实验一：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

实验目的：

1. 掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的方法及实验原理。 2. 了解血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的临床意义及影响因素。

实验原理：带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。血清蛋白质的等电点均低于pH7.4，因此，在pH比其等电点高的缓冲液中它们都电离成负离子，在电场中都会向正极移动。因各种血清蛋白质等电点不同，在同一pH下所带电荷数量不同，加上分子量的差别等因素，它们在电场中的运动速度就不同。蛋白质分子小而带电荷多的运动较快；分子大而带电荷少的运动较慢。所以可利用电泳将血清蛋白质按其在电场中运动的速度快慢分为白蛋白、α1－球蛋白、α2－球蛋白、β－球蛋白及γ－球蛋白等五条区带。可用分光光度法定量检测出五种蛋白质的含量和百分数，也可将染色后的膜条直接用光密度计测定。实验器材：

【仪器】

1．试管、试管架、吸量管

2．电泳仪：包括直流电源整流器和电泳槽两个部分，电泳槽内装有两个电极（用白金丝制成）。

3．醋酸纤维薄膜（2.5×8㎝）：【试剂】

1．pH8.6，离子强度0.075的巴比妥缓冲液：巴比妥钠15.45g，巴比妥2.76g，蒸馏水700～800 ml，加热溶解，冷后补足蒸馏水至1000ml。

2．氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.5g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml，混合使溶解。

3．漂洗液：甲醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀，分装甲乙丙三瓶备用。 4．新鲜血清

5．0.4mol/L氢氧化钠溶液

6．透明液：冰醋酸25ml，无水乙醇75ml，混匀备用。实验内容与方法：

1.电泳槽的准备：将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两槽液面在同一水平。两槽内侧边各贴挂四层滤纸或纱布，浸入缓冲液中构成盐桥。

2．薄膜的准备与点样：取2.5×8cm的膜条

（1）薄膜有光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透下沉，约浸泡10－20分钟，即膜条无白斑时。

（2）将充分浸透的膜条取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，于薄膜的无光泽面距一端1.5cm处作为点样线。

（3）用点样器在盛有血清的表面血中蘸一下，点样器下端粘上薄层血清，然后将点样器竖直，使其沾有血清的顶端紧贴在薄膜点样线上，待血清全部渗入膜内后，移开点样器，注意点样的两端不可到边。

2．电泳：将点样后的膜条置于电泳槽的盐桥上，放置时膜条无光泽面（即点样面）向下，以防薄膜干燥，点样端置于负极，槽架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧。盖好电泳槽的盖，待平衡5分钟后，即可通电。调节电泳仪，使两极间距（指膜条与滤纸桥总长度）的电压为8～10V/cm长，或电流0.4～0.6mA/cm宽，通电50分钟左右关闭电源。

3．染色与漂洗：通电完毕后，用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染3分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液甲、乙、丙三瓶中各漂洗5'，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜，即得五条蛋白区带，从阳极至阴极端依次为白蛋白、α1－球蛋白、α2－球蛋白、β－球蛋白及γ－球蛋白，。实验注意事项：

1．点样是实验成功的关键，点样不可太多或太少。 2．电泳和漂洗时不要拿错膜条。实验报告：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳思考题：

血清蛋白质在pH8.6的巴比妥缓冲液中带什么电荷?它们泳动的先后顺序如何?为什么？

实验二蛋白质两性电离与等电点的测定

实验目的：

1. 了解蛋白质两性电离与等电点的测定原理。 2. 熟悉蛋白质两性电离与等电点测定的操作方法。

3. 培养学生严谨的作风和准确地进行实际操作的能力，提高分析问题的能力。实验原理：蛋白质是两性电解质,其电离过程取决于溶液的PH值。若当PH大于蛋白质的PI时，蛋白质带负电荷，不易沉淀。反之，当PH小于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，也不易沉淀。当溶液处于某一PH值时，蛋白质所带的正、负电荷数量相等，净电荷为零，呈兼性离子状态，此时溶液的PH值称为这种蛋白质的等电点（PI）；这时的蛋白质在电场中既不向负极也不向正极移动；溶解度最低，容易析出。所以当溶液处于PI时，沉淀最多。实验器材：

【仪器】

试管、试管架、吸量管【试剂】

⒈ 5g/L酪蛋白醋酸钠溶液: 称取纯酪蛋白0.5g，加蒸馏水40ml及1.00mol/L氢氧化钠溶液10.0ml，振摇使酪蛋白溶解，然后加入1.00mol/L醋酸溶液10.0ml，混匀后倒入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀。

2．0.1g/L溴甲酚绿指示剂：该指示剂变色范围为PH 3.8－5.4。酸色型为黄色，碱色型为蓝色。

3．0．02mol/L盐酸溶液 4．0．02mol/L氢氧化钠溶液 5．1.00mol/L醋酸溶液 6．0.1mol/L醋酸溶液 7．0.01mol/L醋酸溶液实验内容与方法：

一. 蛋白质两性电离实验

1．取试管一支，加入5g/L酪蛋白醋酸钠溶液0.3ml，0.1g/L溴甲酚绿指示剂1滴，混匀，观察溶液呈现的颜色。

2．用乳头滴管缓慢滴加0．02mol/L盐酸溶液，随滴随摇，直到有明显的大量沉淀发生。观察溶液颜色的变化。

3．继续滴入0．02mol/L盐酸溶液，观察沉淀与溶液颜色的变化。

4．再滴入0．02mol/L氢氧化钠溶液，随滴随摇，使之再度出现明显的大量沉淀，再继续滴入0．02mol/L氢氧化钠溶液，沉淀又溶解，观察溶液颜色的变化。二酪蛋白等电点的测定：

1．取试管5支，按下表操作：

加入物（ml） 1 2 3 4 5 蒸馏水 1.6 － 3.0 1.5 3.38 1.00mol/L醋酸溶液 2.4 －－－－ 0.10mol/L醋酸溶液－ 4.0 1.0 －－ 0.01mol/L醋酸溶液－－－ 2.5 0.62 5g/L酪蛋白醋酸钠溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 溶液的最终PH 3.2 4.1 4.7 5.3 5.9 2．静置20分钟，观察各管沉淀出现情况。并以“－、＋、＋＋、＋＋＋”记录沉淀多少。实验注意事项：

仔细观察并记录蛋白质两性游离实验中沉淀及沉淀消失的现象。实验报告：

⒈蛋白质两性电离 ⒉酪蛋白等电点的测定思考题：

1. 讨论蛋白质两性电离实验中沉淀及沉淀消失的原因？ 2. 酪蛋白等电点是多少?为什么？

实验三血清总蛋白测定 ————双缩脲法

实验目的：

1. 熟悉血清总蛋白测定的原理及基本操作。 2. 掌握血清总蛋白测定的临床意义。

实验原理：蛋白质分子中的肽键（-CONH-）在碱性条件下能与Cu2+ 作用形成紫红色络合物。此呈色反应与双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与Cu2+ 作用产生紫红色的反应相似，故称为双缩脲反应。反应中溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用分光光度法定量检测蛋白质的含量。

凡具有两个以上肽键结构的化合物均有此反应，因此双缩脲反应广泛用于肽及蛋白质定性、定量检测。

实验器材：

恒温水浴箱、分光光度计、刻度吸管、试管、试管架。【试剂】

1．6mol／L （24%）NaOH溶液称取NaOH（优级纯）240g，溶解于新鲜蒸馏水中并加至1000ml。置聚乙烯瓶内盖紧室温保存。

2. 双缩脲试剂精确称取结晶硫酸铜(CuSO4·5H20)3.0g，酒石酸钾钠

(NaKC4H4O6·4H2O)9.0g，碘化钾(KI)5.0g，分别溶解于是25m1蒸馏水中。将酒石酸钾钠和碘化钾溶液倒入1000ml容量瓶中，加入6mol／L氢氧化钠溶液100ml，混匀，再加硫酸铜溶液，边加边摇，最后加蒸馏水稀释至1000ml。置聚乙烯瓶内盖紧，室温保存。

3．10g/L酪蛋白标准液酪蛋白要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，再根据其纯度称量，用0.05mol/L氢氧化钠溶液配置，冰冻保存。

4.人血清用蒸馏水稀释10倍，使其蛋白质浓度在标准曲线测试范围内。实验内容与方法：

取3支试管，按表操作：加入物（ml）血清稀释液酪蛋白标准液双缩脲试剂测定管标准管空白管 0.1 －－－ 0.1 － 5.0 5.0 5.0 9

充分混匀，置37℃水浴中10分钟（或25℃30分钟），在0nm波长处进行比色，以空白管调零，读取各管吸光度。

【计算】

血清总蛋白（g/L）＝测定管吸光度标准管吸光度× 蛋白标准液浓度

【临床意义】 1.血清总蛋白降低

（1）合成障碍：肝功能严重受损时，蛋白质合成减少，其中以清蛋白下降最为明显。

（2）丢失过多：见于严重烧伤时大量血浆渗出，大失血，肾病综合征时大量蛋白尿，溃疡性结肠炎时肠道长期丢失一定量的蛋白质等。

（3）营养不良或消耗增加:长期低蛋白饮食、慢性胃肠道疾病所引起的消化道吸收不良，使体内缺乏合成蛋白质的原料，或长期患消耗性疾病，如结核病、恶性肿瘤、甲状腺功能亢进等均可引起血清蛋白浓度降低。

（4）血液稀释：静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。 2.血清总蛋白增高

（1）血液浓缩：急性失水（严重腹泻、呕吐、高热等），休克（毛细血管的通透性增加），慢性肾上腺皮质功能减退, 急性失水尿钠增多引起继发性脱水。

（2）合成增加:主要是球蛋白合成增加，如多发性骨髓瘤。【正常参考范围】 60～80g/L 实验注意事项：

1．由于各种蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用mol/L表示，而用g/L表示。 2.试管、吸管应清洁，否则会有混浊现象出现。

3.高脂、黄疸和溶血标本应作血清空白对照，以保证结果准确。含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色。

4.须于显色30分钟内比色，否则可有雾状沉淀产生，同时注意各管从显色到比色的时间应尽可能一致。

5.避免硫酸铜过量，否则生成氢氧化铜，其蓝色将掩盖紫红色，影响测定结果。实验报告：血清总蛋白测定（双缩脲法）思考题：

蛋白质常见的呈色反应有哪些？本实验结果如何，请分析。

————Folin—酚法

目的要求

（1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法；（2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。实验原理

目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量克氏定氮，双缩脲反应，Folin—酚试剂法（Lowry法）。这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求和实验条件进行选择。目前实验室多用Folin—酚法测定蛋白质含量。此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以稳定几个小时。其不足之处就是此反应受多种因素干扰。在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。

此法是在Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin—酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。

Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。

本法可测定范围是25—250ug蛋白质。试剂和器材一、试剂

Folin—酚试剂:

试剂甲： 1) 4%碳酸钠溶液

2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液 3) 1%硫酸铜溶液 4) 2%酒石酸钾钠溶液。

临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。

试剂乙：

称钨酸钠（Na2WO2•2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）25g置2000ml磨口回流装置内，加蒸馏水700ml，85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000ml，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。

试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。二、标准和待测蛋白质溶液

1. 标准蛋白质溶液

结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150ug/ml蛋白溶液

2. 待测蛋白质溶液

人血清，使用前稀释150倍。三、器材

试管及试管架；0.5,1,及5ml移液管，恒温水浴，UV－2000型分光光度计。操作方法一、制作标准曲线

取14支试管，分两组按下表平行操作：

试管编1 号试剂处理标准蛋白质溶液0 /ml 蒸馏水/ml 1.0 2 3 4 5 6 7 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.9 5.0 0.8 5.0 0.6 5.0 0.4 5.0 0.2 5.0 0 5.0 Folin-酚甲试剂5.0 /ml 摇匀，于20—25℃放置10min Folin-酚乙试剂0.5 /ml 迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在0nm*处比色 A0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 * 由于这种显色化合物组成尚未确定，它在可见光红光区呈现较宽吸收峰区。不同书籍选用不同的波长，有选用500或0nm的，有选用660,700或750nm的。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收。本实验选用0nm。

绘制标准曲线：以A0值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

二、未知样品蛋白质浓度测定

取4支试管，分2组，按下表平行操作：试管编号试剂处理血清稀释液/ml 蒸馏水/ml Folin－酚甲试剂/ml 0 1.0 5.0 0.2 0.8 5.0 空白管×2 样品管×2 摇匀，于20—25℃放置10min Folin－酚乙试剂/ml 0.5 0.5 迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在0nm* 13

处比色 A0 三、计算

A0值对应标准曲线蛋白质含量106蛋白质（g)/100ml血清血清稀释倍数100测定时用稀释血清的ml数

注意事项

(1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前。

(2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。思考题：

1. Folin－酚测定蛋白质的原理是什么？ 2. 有哪些因素可干扰Folin－酚测定蛋白含量？

实验四 pH 与温度对酶促反应的影响

实验目的：

1. 通过实验观察pH对酶促反应的影响。 2. 提高分析问题和动手能力。

实验原理：淀粉在淀粉酶催化下水解，其最终产物是麦芽糖和葡萄糖。在水解反应过程中淀粉的分子量逐渐变小，形成若干分子量不等的过渡性产物，称为糊精。向反应系统中加入碘液可检查淀粉的水解程度，淀粉遇碘呈蓝色，麦芽糖对碘不显色。糊精中分子量较大者呈蓝紫色，随糊精的继续水解，对碘呈橙红色。

根据颜色反应，可以了解淀粉被水解的程度。在不同温度、不同酸碱度下，唾液淀粉酶活性不同，淀粉水解程度也不一样。进而了解温度及pH对酶促反应的影响。实验器材：

【器材】：

加入物 10g／L淀粉溶液 PＨ3.0缓冲液 PH6.8缓冲液 PH9.0缓冲液 1 2 3 10滴 10滴 10滴 10滴 — — — 10滴 — — — 10滴摇匀后37℃恒温水浴中保温5分钟

稀唾液 5滴 5滴 5滴 10mm×100mm试管、试管架、恒温水浴箱、沸水浴、记号笔、一次性杯子【试剂】：

1．10g／L淀粉溶液：配制方法：取可溶性淀粉1克，加5毫升蒸馏水，调成糊状，再加蒸馏水约80毫升，加热，使其溶解，最后用蒸馏水稀释至100毫升，冰箱保存。

2．稀释唾液：将痰咳尽，用水漱口(洗涤口腔)，再含蒸馏水30毫升，作咀嚼动作，2分钟后吐入烧杯中待用。

3．缓冲溶液：

PH6.8磷酸盐缓冲液：取磷酸氢二钠477mg，磷酸二氢钠397 mg，蒸馏水溶解至100ml。 PＨ3.0缓冲液：取0.2mol/L磷酸二氢钾（KH2PO4 2.722克加蒸馏水溶解至100ml）50 ml ，加0.2 mol/L盐酸溶液20.3 ml,混合后即成。

PＨ9.0缓冲液：取0.2mol/L Na2HPO4溶液（磷酸氢二钠2.840克加蒸馏水溶解至100ml ）60ml,0.2 mol/L氢氧化钠溶液20 ml,混合后即成。

4．碘溶液取碘化钾4g溶于少量蒸馏水中，再取碘2g，完全溶解后加蒸馏水至300ml，贮于棕色瓶中。实验内容与方法：

一、PH对酶促反应的影响取三支试管按下表操作：

表 PH对酶促反应的影响

将上面各管摇匀后放入37℃恒温水浴中保温。放置10分钟后取出，分别向各管加入稀碘液1滴，观察3管中颜色的区别，说明PH对酶促反应的影响。

二、温度对酶促反应的影响：取三支试管按下表操作：

表温度对酶促反应的影响

加入物 10g／L 淀粉溶液 PH6.8缓冲液 1 2 3 10滴 10滴 10滴 10滴 10滴 10滴摇匀后分别于37、沸水、冰浴5分钟稀唾液 5滴 5滴 5滴摇匀后分别于37、沸水、冰浴10分钟

取出后，分别向各管加入稀碘液1滴，观察3管中颜色的区别，说明温度对酶促反应的影响。实验注意事项：

稀释唾液的制备是实验成功与否的关键。制备稀释唾液时,口含的时间不能太长或太短，约1～2分钟。

实验报告：pH 、T对酶促反应的影响思考题：

利用所学知识，说明T与pH对酶促反应的影响机制，分析结果。

实验六酶的特异性

实验目的：

1. 通过实验说明酶具有特异性。 2. 提高分析问题和动手能力。

实验原理：淀粉在淀粉酶催化下水解，产物是麦芽糖和G。麦芽糖和G具有还原性,可使班氏试剂中二价铜离子还原为一价铜离子，生成砖红色氧化亚铜沉淀。而淀粉酶不能催化蔗糖水解生成G和F，蔗糖也不具有还原性，故不能使班氏试剂中二价铜离子还原，不能产生颜色变化。实验器材：

【器材】：

10mm×100mm试管、试管架、恒温水浴箱、沸水浴、记号笔、一次性杯子【试剂】：

1．10g／L淀粉溶液：（同实验四） 2．10g／L蔗糖溶液 3．稀释唾液：（同实验四）

4．PH6.8磷酸盐缓冲液：（同实验四）

5．班氏试剂：结晶硫酸铜（CuSO4 。H2O）17.3g溶于热蒸馏水100ml中，冷后稀

释至150ml，此为第一液。柠檬酸钠173g及无水碳酸钠100g，蒸馏水600ml，加热溶解，冷后稀释至800ml，此为第二液。将第一液慢慢倒入第二液中，混匀后即为班氏试剂。实验内容与方法：

取三支试管编号，按下表操作：

表酶的特异性

加入物（滴） PH6.8磷酸盐缓冲液 10g／L淀粉溶液 10g／L 蔗糖溶液稀释唾液煮沸稀释唾液班氏试剂结果（颜色） 10 1 5 5 - 3 - 2 5 5 - - 3 混匀，37℃水浴10分钟 10 沸水浴10分钟 10 3 5 - 5 3 - 观察3管中颜色的区别，说明酶的特异性实验注意事项：

稀释唾液的制备。实验报告：酶的特异性

思考题：实验结果如何，分析结果。

实验七：琥珀酸脱氢酶活性的抑制

实验目的：

1. 通过琥珀酸脱氢酶活性的抑制说明竞争性抑制剂对酶促反应的影响。 2．说明竞争性抑制剂对酶的影响特点。 3. 提高分析问题和动手能力。实验原理：

琥珀酸脱氢酶可催化琥珀酸脱氢，并将脱下的氢传给亚甲蓝（甲烯蓝），使蓝色的亚甲蓝变为无色的亚甲白（甲烯白）。借此观察琥珀酸脱氢酶活性。丙二酸与琥珀酸结构相似，故能冒充琥珀酸占据琥珀酸脱氢酶的活性中心，使琥珀酸脱氢酶的活性被抑制。本实验将证明丙二酸抑制作用及其抑制特点。实验器材：

[器材]

10mm×100mm试管、试管架、恒温水浴、蜡笔 [试剂]

1．200mmol/L琥珀酸溶液: 琥珀酸2.36g,加少量蒸馏水溶解后，用0.2mol/L氢氧化钠调至PH值7.4, 再加蒸馏水至100ml。

2．20mmol/L琥珀酸溶液: 取200mmol/L琥珀酸溶液用蒸馏水作10倍稀释。 3．200mmol/L丙二酸溶液：丙二酸2.32g，加少量蒸馏水溶解后，用0.2mol/L氢氧化钠调至PH值7.4, 再加蒸馏水至100ml。

4．20mmol/L丙二酸溶液: 取200mmol/L丙二酸溶液用蒸馏水作10倍稀释。 5．甲烯蓝溶液：甲烯蓝0.02g，加蒸馏水溶解至100ml。 6．石蜡油实验内容与方法：

1．肌肉提取液的制备：大鼠断头放血处死，取大腿肌肉约5克剪碎，置烧杯内用冷蒸馏水水洗三次，洗去肌肉中的可溶性物质和其他受氢体，以减少对实验的干扰，将肌肉碎块移入研钵中，加约10毫升冰冷的蒸馏水研磨得匀浆，离心沉淀，取上层清液冷藏备用。

2．取试管5支，按下表操作：加入物（滴） 1 2 3 4 5 18

肌肉提取液 200mmol/L琥珀酸溶液 20mmol/L琥珀酸溶液 200mmol/L丙二酸溶液 20mmol/L丙二酸溶液蒸馏水甲烯蓝溶液 10 10 10 10 —— 5 5 5 —— 5 —— —— —— 5 —— —— 5 —— 5 —— —— —— 5 —— —— 5 —— —— —— 15 3 3 3 3 3 3.将上述各管摇匀，分别加石蜡油适量覆盖液面，以隔绝空气，放置37℃水浴箱中保温，观察各管蓝色消退情况。实验注意事项：

肌肉提取液的制备是实验成功与否的关键。实验报告：

琥珀酸脱氢酶活性的抑制思考题：

通过实验，说明丙二酸抑制作用及其抑制特点。

实验八分光光度计的使用

实验目的：

1.了解分光光度法的基本原理，熟悉721分光光度计的操作方法，为今后使用该仪器奠定基础。

2. 在实验中培养学生严谨的作风和准确进行实际操作的能力，提高分析问题的能力。实验原理：

有色溶液颜色的深浅与其中呈色物质的含量成正比关系。在定量分析中，利用比较有色物质溶液的颜色深浅来测定物质含量的分析方法称比色法。被测物质中，有的本身就是有色物质，但多数被测物质本身无色或颜色很浅，须加入某些化学试剂使测物质与之发生反应生成有色物质。

物质的颜色是由于物质吸收某种波长的光线以后，通过或反射出某种颜色的结果。当一定波长的单色光通过该物质的溶液时，该物质都能有一定程度的吸光作用，单位体积内的溶液中该物质的质点数越多，对光线吸收越多。利用物质对一定波长光线吸收的程度来测定物质含量的方法，称为分光光度法。

分光光度法依据Lambert-Beer定律。设一束单色光I0射入溶液，由于部分光线被溶液吸收，通过的光线为It，则It/I0之比为透光度，若透光度T（%）。则

T= It/I0×100% （1）

透光度（T）的倒数（1/T）反映了物质对光的吸收程度。在实际应用时，取（1/T）的对数值，做为吸光度用A表示，即：

A=Lg（1/T）=-LgT （2）吸收度（A）又称消光度（E）或光密度（OD）。

根据Lambert-Beer定律推导，当一束平行单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液温度等条件不变条件下，溶液对光的吸收度（A）与溶液的浓度（C）及液层厚度（L）的乘积成正比。即： A=KCL （3）

在实际比色时，标准溶液与被测溶液使用相同的比色杯，即液层厚度（L）相同。K为常数。测定同一种物质时，K标=K测。所以，将比简化为仅是溶液对光吸收度（A）与其浓度（C）之间的关系。即溶液的浓度越大，吸光度越大。可以通过测定吸光度求知某一溶液的浓度。

设：测定管的吸光度和浓度分别为A测和C测，标准管吸光度和浓度分别为A

标

和C标，根据（3）式A=KCL得知： A测：A标= C测：C标则 C测= A测/ A标×C标

上式中C标为已知，A测与A标可在比色时读出数值，把这些数值代入公式，即可求出

测定管浓度。实验器材：

[器材]：721-分光光度计 [试剂] 实验内容与方法：

1．接通电源，打开开关指示钮，打开比色箱盖，预热20分钟。 2．预热后，选择所需波长、转动灵敏度旋钮选择适宜灵敏度。

3．转动0旋钮，使检流针指针对准T为0，将空白液、标准液、测定液分别倒入4个比色杯中，将比色杯放入比色盒，再将比色盒放入比色箱中，使空白液对准光路，合

上比色箱盖。4．转动100旋钮，使T为100%（A为0），观察指针是否稳定。

5．反复几次调节T=0、T=100%即开盖调“0”，闭盖调“100”。

6．轻轻拉动比色槽拉杆，先后将标准液、测定液对准光路，纪录A标值和A测值。 7．比色完毕，恢复各旋钮至原来位置，关闭电源拔下插头，取出比色杯，合上比色箱盖，套上布罩。将比色杯洗净后倒置晾干。

8．计算 C测= A测/ A标×C标

根据公式算出C测数值。

实验报告：分光光度计的使用

思考题：分光光度计的使用的原理及意义。

实验九：血糖浓度测定（葡萄糖氧化酶法）

实验目的：

1. 了解血糖浓度测定的原理和方法。

2. 在实验中培养严谨的作风和准确进行实际操作的能力，提高分析问题的能力。实验原理：

在PH7.0条件下,葡萄糖氧化酶可催化葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2，后者在H2O2酶的作用下与苯酚、4-氨基安替吡啉生成红色醌类物质，在505nm处有最大吸收峰,吸光度与葡萄糖含量成正比。实验器材：

[器材]：10mm×100mm试管、试管架、恒温水浴、沸水浴、冰浴、蜡笔、721-分光光度计

[试剂]

⒈ 酶酚混合试剂主要成分：

① 葡萄糖氧化酶 ② H2O2酶 ③ 苯酚 ④ 4-氨基安替吡啉 ⒉ 葡萄糖标准储存液（100mmol/L）

⒊．葡萄糖标准应用液（5mmol/L）取葡萄糖标准储备液5ml，置于100ml容量瓶中，加苯甲酸溶液至刻度。实验内容与方法：

1．取16×150mm试管3支按下表进行操作：

试剂（ml）测定管标准管空白管

血清或血浆 0.1 — — 葡萄糖标准应用液 — 0.1 — 蒸馏水 — — 0.1 酶酚混合试剂 3.0 3.0 3.0

2．将上述各管混匀放入37℃水浴中加热15分钟，用波长505nm分光光度计进行比色，空白管调零点读取测定管与标准管吸光度。

3．计算

测定管吸

血糖（mmol/L）= × 5 光度标准管吸光度 4．正常值为3.～6.11 mmol/L(70～110mg/dl)。实验注意事项：

血清加量要准，否则会影响到结果的准确性。实验报告：血糖浓度测定思考题：

1．实验结果如何，分析结果。

2．讨论血糖升高和降低的临床意义及其维持恒定的因素？

实验十肝中酮体生成作用

实验目的：

1. 通过酮体生成实验说明酮体生成只能在肝脏。

2. 了解酮体生成实验的方法及原理，提高分析问题和动手能力。实验原理:

利用丁酸作为底物,与肝匀浆保温后有酮体生成,酮体可与含亚硝基铁氢化钠的显色粉反应产生紫色化合物,而经同样处理的肌匀浆,则不产生酮体,因此与含亚硝基铁氢化钠的显色粉反应不产生紫色化合物。实验器材：

[器材]

10mm×100mm试管、试管架、恒温水浴、沸水浴、冰浴、蜡笔 [试剂] 1．0.9% 氯化钠

2．洛克溶液：氯化钠0.9g，氯化钾0.042g，氯化钙0.024g，碳酸氢钠0.02g，葡萄糖0.1g，将上述各试剂放入烧杯中，加蒸馏水100ml，溶解后混匀，置冰箱中保存备用。

3．0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PＨ7.6)：准确称取二水合磷酸氢二钠7.74g和一水合磷酸二氢钠0.7g，用蒸馏水稀释至500ml，精确测定PH值。

4．0.5mol/L丁酸溶液：取44.0g正丁酸溶于0.1mol/L氢氧化钠中，溶解后用0.1mol/L氢氧化钠稀释至1000ml.

5.15%三氯醋酸溶液

6.显色粉：亚硝基铁氢化钠1g，无水碳酸钠30g，硫酸铵50g，混合后研碎。实验内容与方法：

1.肝匀浆、肌匀浆的制备：大鼠断头放血处死，迅速剖腹，取出肝和肌组织，分别移入研钵中，加生理盐水（按重量：体积＝1：4）研磨得匀浆。

2.取试管4 支，按下表操作：

试管（滴）洛克溶液 0. 5mol/L丁酸溶液 0. 1mol/L磷酸盐缓冲液肝匀浆肌匀浆 DH20 分别于37水浴20分钟取出后,各管加15%三氯醋酸溶液20滴,摇匀。离心5分钟(3000转/分)。分别取出上述各离心管10滴，放于白瓷反应板上，并加一小匙显色粉，观察颜色反应。实验注意事项：

肝匀浆的制备是实验成功与否的关键。不要将吸肝匀浆的滴管吸肌匀浆。实验报告：酮体生成实验思考题：

1 2 3 4 15 15 15 15 30 __ 30 30 15 15 15 15 20 20 __ __ __ __ __ 20 __ 30 20 __ 通过实验，证明肝匀浆保温后有酮体生成,而经同样处理的肌匀浆,则不产生酮体，分析原因。

实验十一血清胆固醇测定（CE-COD-POD酶法）

实验目的

1．了解酶法测定胆固醇含量的基本原理及实验方法。 2．掌握胆固醇含量测定的意义。实验原理

胆固醇酯经胆固醇酯酶(CE)水解生成游离胆固醇和脂肪酸，此游离胆固醇和血清中原有的游离胆固醇，经胆固醇氧化酶(COD)催化生成4-胆甾-3-烯酮和过氧化氢(H2O2)，过氧化氢的量与总游离胆固醇的量成正比。过氧化氢与4-氨基安替比林和酚(4-AAP)，再经过氧化物酶(POD)催化，生成红色醌亚胺，其颜色深浅与过氧化氢的量成正比。与同样方法处理的胆固醇标准液，用分光光度计，在500nm波长下进行比色，即可求得血清总胆固醇含量。

化学反应如下：

胆固醇酯游离胆固醇+脂肪酸

游离胆固醇+O2 4-胆甾-3-烯酮+过氧化氢

过氧化氢+4-AAP 醌亚胺（红色）+HO2 该法适于胆固醇浓度的范围在13mmol/L(500mg/dl)以内。实验器材：

[器材]

分光光度计、普通台式离心机、试管、微量加样器、微量加样头、刻度吸管电热恒温水浴箱、试管架 [试剂] 1．血清

2．酶试剂组成因不同商品试剂盒而异，酶用量也因酶制品的质量而定。进口酶试剂将三种酶(胆固醇酯酶150U/L，胆固醇氧化酶≥100U/L，过氧化物酶≥5000U/L)与

胆固醇酯酶

胆固醇氧化酶

过氧化物酶

0.4mmol/L4-氨基安替比林和酚以1瓶干粉的形式供应。用前用20ml缓冲液复溶即为胆固醇反应试剂，该试剂2～8℃下可稳定30天。

3．0.1mmol/L pH6.5磷酸盐缓冲液

4．5.2mmol/L胆固醇标准液一般应使用与酶试剂配套的标准液。或称取纯胆固醇200mg，溶于含20%吐温20的100ml生理盐水中，2～10℃保存。实验内容与方法：

取3只试管编号后，按下表加入各试剂：

加入物血清蒸馏水胆固醇标准液酶试剂

混匀，37℃下反应10min，用分光光度计，在500nm波长下，以空白管调零，读取各管吸光度。

测定管A 加入量，ml 空白管 —— 0.01 —— 1.0 标准管 —— —— 0.01 1.0 测定管 0.01 —— —— 1.0 计算：血清胆固醇浓度（mmol/L）= ×5.2（mmol/L）实验注意事项

标准管A 1．注意酶试剂的选择、使用和保存。所用酶试剂盒，以国内产品为多，应选择最佳厂家的产品为宜。变质试剂，切勿再用。

2．注意胆固醇标准液的质量，批间有无差异。

3．待测血清不能溶血，2～10℃下保存不能超过7天，冰冻保存不可超过半年。 4．血清中的维生素和胆红素过高可使结果偏低，血红蛋白会使结果偏高。实验报告：血清胆固醇测定思考题：

1．酶法操作的关键是什么?

2．酶法与化学比色法比较有哪些特点?

实验十二：血清ALT定量测定

实验目的：

1. 掌握血清ALT定量测定实验的原理及临床意义。 2. 提高分析问题和动手能力。实验原理：

血清ALT以肝细胞中含量最多，因此当肝细胞有病变时，细胞中的酶释放入血液，血清中ALT活性增高。

丙氨酸 + α-酮戊二酸 → 丙酮酸 + 谷氨酸

丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼 → 丙酮酸-2，4-二硝基苯腙

丙酮酸-2，4-二硝基苯腙在碱性溶液中显棕红色，在520nm处比色测定，根据丙酮酸生成量的多少可求得ALT的活性单位。实验器材：

[器材] 10mm×100mm试管、试管架、蜡笔、恒温水浴箱、分光光度计 [试剂]

1． 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PＨ7.4)：准确称取磷酸氢二钠（AR）11.928g和磷酸二氢钠（AR）2.176g，用蒸馏水溶解至100ml。

2．丙酮酸标准溶液（2mmol/L）：准确称取丙酮酸22.0ml于100ml容量瓶中，加PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度，分装好，高压灭菌，冷后置冰箱保存。

3．2，4-二硝基苯肼溶液：称取2，4-二硝基苯肼19.8mg, 用10mol/LHCL10ml溶解，加蒸馏水至100ml，置棕色瓶内，冰箱保存。

4．ALT基质液: 称取DL丙氨酸1.79g, α-酮戊二酸29.2mg于烧杯中,加PＨ7.4磷酸盐缓冲液80ml, 煮沸溶解,冷后用1mol/L氢氧化钠液调PＨ至7.4,(约加0.5ml),移入100 ml容量瓶中，再用PＨ7.4磷酸盐缓冲液稀释至100 ml刻度,混匀,加氯仿数滴或10g/L麝香草酚酒精溶液1ml,防腐, 冰箱保存。

5． 0.4mol/L氢氧化钠液实验内容与方法：

取三支试管编号，按下表操作：

加入物(ml) 血清丙酮酸标准溶液 ALT基质液标准管测定管空白管 --- 0．1 0．1 --- 0．1 --- 0．5 0．5 --- 37℃水浴30分钟 2，4-二硝基苯肼溶液 ALT基质液工作液蒸馏水样本

空白管 1.00ml 0.10ml ---

0．5 --- 0．5 --- 0．5 0．5 样品管 1.00ml --- 0.10ml

37℃水浴20分钟

0.4mol/L氢氧化钠液吸光度（A） 5．0 5.0 5.0 混匀后静置10分钟，用520nm波长比色，空白管调零，读取各管吸光度。计算：

ALT单位=测定管吸光度÷标准管吸光度×20×1/2.5×1/0.1

实验注意事项：

1．血清及标准液的加量要准确。

2．温度的控制也很重要。实验内容与方法二：

波长：340 nm

反应温度：25OC 30 OC 37 OC 比色杯半径：1cm

取一定量R2复溶1瓶R1，溶解后即成工作液，工作液预先保温至测试温度混合均匀后，在反应温度保温1分钟，读取初始吸光度，同时开始记时，在精确1，2，3，分钟时，分别读取吸光度，确定每分钟平均吸光度

计算：ALT（U/L）=（△A样品/分-△A空白/分）*F F=Vt*1000/Vs*消光系数=1746

Vt反应总体积 Vs样品体积实验注意事项：

1.测定时间1分钟，△A/分大于0.340,测定时间3分钟，△A/分大于0.170，用生理盐水稀释样品后重新测定，结果乘以稀释倍数。

2.试剂空白吸光度小于1.000时，勿用。

3.试剂加样品60秒后测定，以防人血清丙酮酸的干扰。 4.内含叠氮钠，避免直接接触皮肤和眼睛。 5.试剂保存于2-8OC 实验报告：血清ALT活性测定思考题：

1．实验结果如何，分析结果。

2．说出血清ALT活性测定的方法及临床意义。

实验十三：血红蛋白与核黄素的凝胶柱色谱分离实验目的：

1. 通过实验了解血红蛋白与核黄素的凝胶柱色谱分离的原理及应用。 2. 提高分析问题和动手能力。初步掌握凝胶层析技术

3、了解包括离子交换柱层析、亲和层析及吸附层析等分离纯化的方法。实验原理：

凝胶层析又称凝胶排阻层析、凝胶过滤、分子筛层析和凝胶渗透层析，是一种按分子大小分离物质的层析方法，广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离和纯化。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形

成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且

呈珠状颗粒的物质。本实验通过凝胶过滤，用核黄素（黄色，分子量267）和血红蛋白（红色，分子量67000）混合物作为样品。核黄素因分子量小，能自由出入凝胶颗粒中，因此就要花费较长的时间流经柱床，在层析柱中呈现其本来的黄色带而远远地落在血红蛋白的后边。实验器材：

[器材]

医用镊子、5ml带刻度滴管、250ml试剂瓶、50ml烧杯；层析柱：Ф10mm×20cm 10支；

[试剂]

1．0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）：量取0.1mol/L磷酸二氢钠280ml与0.1mol/L磷酸氢二钠720ml，混匀。

2．核黄素饱和水溶液 3．生理盐水 4．甲苯

5．葡聚糖凝胶：Sephadex G-25或G-50

6. 血红蛋白样品的制备：取2ml抗凝血于离心管中，2000转/min离心10分钟，使血细胞沉淀，弃去血浆和白细胞层。向红细胞沉淀加入生理盐水4ml，振摇洗涤，2000转/ min离心10分钟,弃去上清液，共洗涤3次。向沉淀加入蒸馏水2ml，混匀，再加入甲苯1ml，猛烈振摇促使红细胞溶血释放血红蛋白。2000转/min离心10分钟,取上清血红蛋白溶液备用。实验内容与方法：

1．葡聚糖凝胶的预处理：取Sephadex G-25 5克或Sephadex G-50 3克,浸泡于50ml蒸馏水中充分溶胀（室温，12h），然后反复倾斜除去表面的悬浮微粒，再加入pH7.2磷酸缓冲液沸水浴中2-3h去除颗粒内部空气，最后加入pH7.2磷酸缓冲液浸泡过夜备用。

2. 装柱

(1) 将层析柱垂直固定在铁架台上，将层析柱出口接上乳胶管，注意上下不要颠倒； (2)

将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约1-2cm高的缓冲液，把溶胀好

的糊状凝胶边搅拌边缓慢倒入柱中，最好一次连续装完，直至凝胶床高达18cm，要求凝胶床无气泡，无断层，表面平整。

3．平衡：以恒流泵控制流速为1滴/5秒，用磷酸缓冲液洗脱平衡10min。注意在

任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则凝胶床可能干裂，影响液体在柱内的流动与分离效果。

4. 制样：将核黄素饱和水溶液和血红蛋白溶液按1：1（体积比）混匀。 6 上样：将柱中多余的液体从底部流出后关闭止水螺丝,取制备好的血红蛋白样品0.5ml，沿层析柱小心加到凝胶柱上，打开止水螺丝，使样品溶液流入柱内。

7 洗脱：用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约1滴/5秒的流速，每3ml一管，721分光光度计比色，在0波长下，以PB调零，测定血红蛋白各管吸光度；在450波长下，以PB调零，测定核黄素各管吸光度，以管号为横坐标，光密度为纵座标绘制图。

8 清洗：待所有色带流出层析柱后，加快流速，继续清洗层析柱2min。注意事项：1、调整好缓冲液的流速后，立即收集洗脱样品。

2、葡聚糖凝胶的预处理由老师提前配好。

实验报告：血红蛋白与核黄素的凝胶柱色谱分离思考题：

1、请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或者太慢？

2、向凝胶柱加样品时，为何须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？

实验四肝组织中核酸的提取和鉴定

实验目的

验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。实验原理

动物组织细胞中的核糖核酸（RNA）与脱氧核糖核酸（DNA）大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白，先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质，再用1.7mol/L NaCl溶液提取出核酸的钠盐，然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。

RNA与DNA均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶)及戊糖（RNA为核糖，DNA为脱氧核糖）。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。

1.磷酸磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（硫酸

亚铁）存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。

2.嘌呤碱根据嘌呤碱能与银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。 3.戊糖根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。

CH3CHOHCOHHCOHHCOHCH2OH核糖CH3浓酸-H2OHOOCHOOHOCO3，5-二羟甲苯H3C糠醛绿色化合物OH

脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。

CHOHCHHCOHHCOHCH2OH脱氧核糖浓酸-H2OCHOHCHHCHCOCH2OHω-羟基-γ-酮基戊醛二苯胺蓝色化合物

实验器材：

[器材]

剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。 [试剂] 1. 生理盐水。

2. 0.12 mol/L三氯醋酸溶液。 3. 95% 乙醇。

4. 10% NaCl溶液 NaCl 10g溶于蒸馏水中，加至100ml。

5. 0.92 mol/L H2SO4 取浓H2SO4（比重1.84，含量98%）5ml加入蒸馏水中，加水至100ml 。

6. 钼酸铵试剂钼酸铵3g，溶于70ml蒸馏水中，逐渐加入浓 H2SO4 14ml ，冷却后再加至100ml，混匀备用。

7. 硫酸亚铁试剂硫酸亚铁10.6g，硫脲5g，加蒸馏水溶解并加水至500ml，冰箱内保存备用。

8. 浓氨水。

9. 0.29mol/L AgNO3 取AgNO3 5g加蒸馏水溶解并稀释至100ml，于棕色瓶避光保存。

10. 3,5二羟甲苯试剂取浓盐酸100ml，加入FeCl3·6H2O 100mg 及二羟甲苯100mg混匀溶解后，置于棕色瓶中。临用前配制，冰箱保存。（市售3,5二羟甲苯不能直接使用，必须用苯重结晶1～2次，并用活性碳脱色后方可使用）。

11.二苯胺试剂取1g纯的二苯胺溶于100ml冰乙酸中，加入2.75ml浓硫酸，盛于棕色瓶中，临用前配制。实验内容与方法：

1.核酸的提取与分离：

（1）将新鲜猪肝剪碎置于匀浆器中，加入等量的生理盐水，制成匀浆。（2）将5ml肝匀浆置于离心管内，立即加入0.12mol/L三氯醋酸5ml，用玻棒搅匀，静置8分钟后离心。

（3）倾去上清液，加95% 乙醇5ml，用玻棒搅匀，再用带有长玻管的木塞塞紧离心管口，在水浴中煮沸2分钟，冷却后离心。

（4）将离心管倒置于滤纸上，使滤纸吸干乙醇。沉淀中再加入10% NaCl溶液4ml，置于沸水浴中加热8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出冷却后再离心。

（5）将上清液倾入另一离心管内，再离心一次，去除可能存在的微量残渣。将上清液倒入烧杯内。

（6）取等量的在水浴中冷却过的95% 乙醇逐滴加入小烧杯内，即可见白色沉淀逐渐析出。静置10分钟后，将小烧杯中沉淀物移入离心管内离心，弃去上清液即得到核酸钠的白色沉淀。

2.核酸的水解在含有核酸钠的离心管内加入0.92mol/L的H2SO4 4ml，用玻棒搅匀，再用带有长玻管的软木塞塞紧管口，在沸水浴中加热15分钟。

3.核酸组成成分的鉴定

（1）磷酸的鉴定：按下表操作。

表1 核酸中磷酸的鉴定

加入物（滴）核酸水解液 0.92mol/L H2SO4溶液

钼酸铵试剂硫酸亚铁试剂

测定管 5滴－ 3滴 10滴

对照管－ 5滴 3滴 10滴

（2）嘌呤碱的鉴定：按下表操作。

表2 嘌呤碱的鉴定

加入物（滴）核酸水解液 0.92mol/L H2SO4溶液

浓氨水 0.29mol/L AgNO3

测定管 10滴－

数滴（使呈碱性）

5滴

对照管－ 10滴数滴（使呈碱性）

5滴

观察加入AgNO3后有何变化。静置15分钟后，再比较两管的沉淀. （3）核糖的鉴定：按下表操作。

表3 核糖的鉴定

加入物（滴）核酸水解液 0.92mol/L H2SO4溶液 3，5-二羟甲基试剂

测定管 4滴－ 6滴

对照管－ 4滴 6滴

混匀，放沸水浴中加热10分钟，观察两管颜色有何不同。（4）脱氧核糖的鉴定：按下表操作。

表4 脱氧核糖的鉴定

加入物（滴）核酸水解液 0.92mol/L H2SO4溶液

二苯胺试剂

测定管 10滴－ 15滴

对照管－ 10滴 15滴

混匀，放沸水浴中加热10分钟，观察两管有何不同。注意事项：

动物组织细胞中的核糖核酸（RNA）与脱氧核糖核酸（DNA）量少，操作不能大意。实验报告：组织中核酸的提取与鉴定思考题：

1、RNA与DNA的组成成分有何异同？

2、观察各测定管颜色及沉淀的生成情况，比较与对照管有何不同，并解释其原因。

实验十五血清尿素氮的测定（二乙酰乙肟法）

实验目的

1.了解血清(浆)尿素氮(BUN)的含量是评价肾脏功能最常用的指标。 2.熟悉二乙酰一肟法测定血清(浆)尿素氮的原理与方法。实验原理

血清(浆)的尿素在氨基硫脲及硫酸镉离子存在下，与二乙酰一肟在强酸溶液中加热，能生成红色复合物，其颜色深浅与尿素含量成正比。与同样处理的尿素标准液比较，即可求得血清(浆)中的尿素含量。实验器材

[器材] 电热恒温水浴箱（100C）、分光光度计、刻度吸管、试管、试管架、三角烧瓶、容量瓶、量筒

[试剂]

1. 血清(浆) 新鲜人或动物血清或血浆，无溶血。

2. 酸性试剂取500ml三角烧瓶一个，加入蒸馏水约100ml后，徐徐加入浓硫酸44ml及85％磷酸66ml。待冷却至室温，加氨基硫脲50mg及八水合硫酸镉(CdSO4·8H2O)2.0g，溶解后，移入1000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释定容至刻度。贮存于棕色瓶中，置冰箱保存可用半年。

3. 2%二乙酰一肟溶液称取二乙酰一肟20.0g，加少量蒸馏水溶解，移入1000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释定容至刻度。贮存于棕色瓶中，置冰箱保存可用半年。

4. 7.0mmol/L尿素氮标准液精确称取干燥纯的尿素42.0mg，加少量蒸馏水溶解后，移入l00ml容量瓶中，再用蒸馏水稀释定容至刻度。加氯仿6滴防腐，置冰箱保存可用数月。实验内容与方法：

1.取试管3支，分别标明“空白管”、“测定管”和“标准管”，按下表进行操作：加入物（ml）血清（浆）蒸馏水尿素氮标准液二乙酰一肟液酶性试剂空白管 — 0.02 — 0.50 5.0 标准管 — — 0.02 0.50 5.0 测定管 0.02 — — 0.50 5.0 2.混匀各管后，置沸水浴箱中加热12min，取出，放冷水浴中冷却5min。

3.在520nm波长下，以空白管调零，用分光光度计测定各管的吸光度。结果处理

注意事项

血清（浆）尿素氮（mmol/L）= ×7.0（mmol/L）

1.本法易受煮沸时间和煮沸时液体蒸发量的影响，因此，测定管和标准管的试管口径和煮沸时间应尽量一致。煮沸时间一般以10～12min为宜。此时，显色较深且色泽稳定。

2.用血浆作标本，显色反应常产生混浊，因此以血清作标本为佳。

3.血清(浆)中的尿酸、肌酐、氨基酸(瓜氨酸例外)等含氮物质对本试验无干扰。 4.尿素氮如超过14.3mmol/L(40mg/dl)，应将血标本用生理盐水适当稀释后测定，将结果乘以稀释倍数。

5.反应系统中氨基硫脲及硫酸镉的存在，有助于红色二嗪衍生物的生成和颜色的稳定，但一般宜在煮沸显色后20～30min内完成比色，否则也有褪色现象发生。

6.如果将尿素氮换算为尿素，则尿素＝尿素氮×2.14。实验报告：血清尿素氮的测定思考题

1.测定尿素氮的临床意义是什么?

2.将尿素氮换算成尿素时，为什么要乘以“2.14”常数。

实验十六：血清总胆红素和结合胆红素测定（改良 J — G 法）实验目的：

1. 通过实验掌握血清胆红素测定的方法。 2. 提高分析问题和动手能力。

3．进一步掌握血清胆红素测定的临床意义。实验原理：

血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应产生偶氮胆红素，所以称为直接胆红素，又称1min胆红素测定。非结合胆红素测定时要以加速剂咖啡因一苯甲酸钠一醋酸钠（咖啡因试剂）破坏胆红素分子内氢键再与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。抗坏血酸破坏剩余重氮试剂。加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素(吸收峰 530nm) 转变成蓝色偶氮胆红素，在 600nm 波长比色，非胆红素的黄色色素及其它红色与棕色色素产生的吸光度降至可忽略不计，使灵敏度和特异性升高，最后形成的绿色是由兰色的碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。实验器材：

[器材]： 10mm×100mm试管、分光光度计、恒温水浴箱、沸水浴、冰浴、记号笔、 [试剂]

1．咖啡因一苯甲酸钠试剂称取无水醋酸钠 41．0g ，苯甲酸钠 38．0g ，乙二胺四乙酸二钠 (EDTA 一 Na )0．5g ，溶于约 500ml 去离子水中，再加入咖啡因 25．0g ，2 搅拌使溶解 (加入咖啡因后不能加热溶解)，用去离子水补足至 1L ，混匀。滤纸过滤，置棕色瓶，室温可保存6个月。

2 ．碱性酒石酸钠溶液称取氢氧化钠 75．0g ，酒石酸钠 (Na2C4H4 O6·2H2O) 263．0g，用去离子水溶解并补足至1L，混匀。置塑料瓶中，室温可保存6个月。

3 ．72．5mmol／L 亚钠溶液（0.50g/L）称取亚钠 5．0g，用去离子水溶解并定容至 100ml（浓度为725mmol／L）,混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于3个月。临用前作10倍稀释成72．5mmol／L，冰箱保存，稳定期不少于2周。

4 ．28．9mmol／L对氨基苯磺酸溶液称取对氨基苯磺酸 (NH2C6H4 SO3H ．H2O) 5．0g，溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸15m1，用去离子水补足至1L 。

5 ．重氮试剂临用前取上述亚钠溶液 0．5ml 和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。

6 ．5．0g／L 叠氮钠(NaN3)溶液取叠氮钠0.50g,用去离子水溶解并稀释至100 ml。 7. 342μmol／L胆红素标准液收集无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜血清，混合。取混合血清1.0ml ，加入新鲜生理盐水24ml，混匀。在 414nm 波长，1cm 光径，以 0.1mmol ／L NaCl 溶液(生理盐水)调零点，其吸光度应小于 0．100 ；在 460nm 的吸光度应小于 0．040。

准确称取符合要求的胆红素（MW584.68）20mg置入,加入二甲亚砜4ml溶解。在50ml 容量瓶中，加入混合血清稀释剂约40ml，缓慢加入上述胆红素二甲亚砜溶液2ml，边加边摇(勿用力摇动，以免产生气泡)。最后以稀释用血清定容。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置4℃冰箱3d内有效线。实验内容与方法：

取试管4支，按下表操作：

改良 J — G 法测定血清总胆红素和结合胆红素

加入物（ml）总胆红素管结合胆红素管空白管标准管血清 0.2 0.2 0.2 — 胆红素标准液 — — — 0.2 咖啡因-苯甲酸钠试剂 1.6 — 1.6 1.6 对氨基苯磺酸溶液 — — 0.4 — 重氮试剂 0.4 0.4 — 0.4 结合胆红素管在加入重氮试剂混匀后准确1分钟,加入5．0g／L 叠氮钠溶液0.05 ml和咖啡因-苯甲酸钠试剂1.6 ml；总胆红素管置室温10min。然后向各管加入碱性酒石酸钠溶液1.2 ml，混匀后，波长600nm ，空白管调零，读取吸光度。

计算：

测定管A × 标准管浓度 = 胆红素μmol／L

标准管A

参考值：

血清总胆红素 5.1～17umol/L 血清结合胆红素 0～6.8umol/L 临床意义:

1 ．血清总胆红素测定的意义 (1) 有无黄疸及黄疸程度的鉴别。

(2) 肝细胞损害程度和预后的判断：胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。

(3) 新生儿溶血症：血清胆红素有助于了解疾病严重程度。

(4) 再生障碍性贫血及数种继发性贫血 ( 主要见于癌或慢性肾炎引起 ) ，血清总胆红素减少。

2. 血清结合胆红素测定的意义：结合胆红素与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。

(1) 比值 <20%：溶血性黄疸，阵发性血红蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。 (2) 比值 40～60% ：肝细胞性黄疸。 (3) 比值 >60 ％：阻塞性黄疸。

但以上几类黄疸，尤其是 (2) 、(3) 类之间有重叠。实验注意事项：

1 ．胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。

2 ．轻度溶血（血红蛋白≤克）对本法无影响，但严重溶血时可使测定结果偏低。其原因是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物可破坏偶氮胆红素，还可被亚氧化为高铁血红蛋白而干扰吸光度测定。高脂血及脂溶色素对测定有干扰，应尽量取空腹血。

3 ．叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。凡用叠氮钠作防腐剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至不呈色。

4 ．本法测定血清总胆红素，在 10 ～ 37 ℃ 条件下不受温度变化的影响。呈色在 2h 内非常稳定。

5 ．标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时可不作标本对照管，参照其他标本对照管的吸光度。

6 ．胆红素大于 342 μ mol ／ L 的标本可减少标本用量，或用 0．1mol／L NaCl 溶液稀释血清后重测。

7 ．结合胆红素测定在临床上应用很广，但至今无候选参考方法，国内也无推荐方法。方法不同，反应时间不同，结果相差很大。时问短、非结合胆红素参与反应少，结合胆红素反应也不完全；时间长，结合胆红素反应较完全，但一部分非结合胆红素也参与反应。这是一个很难权衡的问题。在没有结合胆红素标准液的情况下，问题更复杂。实验报告：血清胆红素测定实验报告思考题:

1．实验结果如何，分析结果。

2．通过实验，利用所学知识，说明血清总胆红素测定的意义。

血清总胆红素的测定二

实验原理：

对氨基苯磺酸+HCI+NaNO2-→氯化重氮苯磺酸+NaCI

氯化重氮苯磺酸+血清总红素→偶氮胆红素（红紫色）实验器材：

[器材]： 10mm×100mm试管、分光光度计、恒温水浴箱、沸水浴、冰浴、记号笔、 [试剂]

1、R1：对氨基苯磺酸盐酸十二烷基二甲基溴化铵 2、R2：亚钠 3、标准总胆红素 4、样本新鲜无溶血血清

实验内容与方法：

波长：6 nm 反应温度：20-25OC 比色杯半径：1cm

将R1和R2以5：1比例混合，即成工作液标准液有2ml蒸馏水复溶后可直接使用。

试剂空白

R1 工作液生理盐水标准样本

--- ---

0.10ml ---

--- 0.10ml

2.00ml --- 0.10ml

--- 2.00ml 0.10ml

2.00ml --- ---

--- 2.00ml ---

试剂

标准

样品空白 2.00ml --- ---

--- 2.00ml --- 样品

分别混合均匀，在反应温度保温度10分钟后，分别读取吸光度A（在60分钟内

吸光度保持不变）

计算：样品中总胆红素浓度C=[（A样品-A样品空白）-（A试剂-A试剂空白）]*F F=C标准/[（A标准-A标准空白）-（A试剂-A试剂空白）]

参考值：

血清总胆红素 5.1～17umol/L

血清结合胆红素 0～6.8umol/L 临床意义:

1 ．血清总胆红素测定的意义 (1) 有无黄疸及黄疸程度的鉴别。

(3) 新生儿溶血症：血清胆红素有助于了解疾病严重程度。

(4) 再生障碍性贫血及数种继发性贫血 ( 主要见于癌或慢性肾炎引起 ) ，血清总胆红素减少。

2. 血清结合胆红素测定的意义：结合胆红素与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。

(1) 比值 <20%：溶血性黄疸，阵发性血红蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。 (2) 比值 40～60% ：肝细胞性黄疸。 (3) 比值 >60 ％：阻塞性黄疸。

但以上几类黄疸，尤其是 (2) 、(3) 类之间有重叠。实验注意事项：

1 ．胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。

3 ．叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。凡用叠氮钠作防腐剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至不呈色。

4 ．本法测定血清总胆红素，在 10 ～ 37 ℃ 条件下不受温度变化的影响。呈色在 2h 内非常稳定。

5 ．标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时可不作标本对照管，参照其他标本对照管的吸光度。

6 ．胆红素大于 342 μ mol ／ L 的标本可减少标本用量，或用 0．1mol／L NaCl 溶液稀释血清后重测。

7 ．结合胆红素测定在临床上应用很广，但至今无候选参考方法，国内也无推荐方法。方法不同，反应时间不同，结果相差很大。时问短、非结合胆红素参与反应少，结合胆红素反应也不完全；时间长，结合胆红素反应较完全，但一部分非结合胆红素也参

与反应。这是一个很难权衡的问题。在没有结合胆红素标准液的情况下，问题更复杂。实验报告：血清胆红素测定实验报告思考题:

1．实验结果如何，分析结果。

2．通过实验，利用所学知识，说明血清总胆红素测定的意义。

实验十七：总糖的测定---蒽酮比色法

一目的掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法

二原理蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。三实验器材及试剂

马铃薯干粉可调试移液器或移液管可见分光光度计（723型）电子分析天平水浴锅电炉子

蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。四、操作 1.制作标准曲线

取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线。

表1 蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作单位：ml 管号标准葡萄糖溶液蒸馏水蒽酮试剂 4.0 4.0 0 0 1.0 1 0.1 0.9 2 0.2 0.8 3 0.3 0.7 4 0.4 0.6 5 0.6 0.4 6 0.8 0.2 置冰水浴中5min 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色葡萄糖浓度（mg/ml）

A620nm 2.样品含量的测定样品液的制作：

精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不时摇动）—→取出，3000rpm离心10min（或过滤）—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中

样品液的测定：

（1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却）表2 蒽酮比色法定糖——样品的测定

单位：ml

试管号样液蒸馏水蒽酮 A620nm 1 0 1.0 4.0 2 1.0 0 4.0 3 1.0 0 4.0 4 1.0 0 4.0 （2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。

（3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。 3．结果计算：

C×V

w = ————×100%

m，式中w：糖的质量分数（%）

C：从标准曲线中查出的糖质量分数（mg/ml） V：样品稀释后的体积（ml）

m：样品的质量（ml）

实验十八：饥饿与饱食对肝糖元含量的影响

一．目的

了解饱食与饥饿对肝糖原的影响，学习组织中糖原的提取和测定方法。二．原理

把动物分成饥饿与饱食两组，用三氯醋酸提取其肝糖原，后者与碘试剂产生颜色反应。与标准液同时比色即可定量。三．材料

（一）仪器 721分光光度计；研钵；试管；漏斗。（二）试剂

1．碘试剂（1）称取1克碘和2克碘化钾，溶于20ml蒸馏水中。（2）19.6%氯化钠溶液取196克氯化钠用蒸馏水溶解并定容至1000ml。将16.5ml的（1）液加到990ml的（2）液中，混匀后贮存于棕色瓶中。

2．5%三氯醋酸溶液称50克三氯醋酸，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。配制后需用标准的0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定（酚酞指示剂）。三氯醋酸的浓度必须在4.9-5.1范围内才能用，否则会影响显色结果。

3．肝糖原标准液（30mg%）精确称取100%纯度的肝糖原30mg，溶于5%三氯醋酸溶液至100ml，贮于冰箱中。四．方法

1．动物准备选择体重相近的健康小白鼠二只，一只照常喂食，另一只饥饿6小时。 2．糖原提取将上述二只小白鼠以断头术杀死，立即取出肝脏，尽快精确称取各0.2克，分别放入研钵内，先加5%三氯醋酸溶液1ml，仔细匀浆，然后再加入5%三氯醋酸溶液9ml，搅匀后静置15分钟，过滤取得肝滤液。

3．糖原的测定取6支试管，编号，按表7-1操作。混匀后，以1号管调零，在520nm波长下测吸光度。表7-1肝糖原的测定

试管（ml） 1 2 3 4 5 6 5%三氯醋酸 2 1 1.5 1.5 1 1 肝糖原标准液 — 1 — — — — 饱鼠肝滤液 — — 0.5 0.5 — —

饥鼠肝滤液 — — — — 1 1 碘试剂 3 3 3 3 3 3 4．计算以3、4两管吸光度平均值为A，5、6两管吸光度平均值为B，标准管吸光度为C.

饱食小白鼠肝糖原克%＝A/C×0.3×1/1000×（10+肝重量）/0.5×100/肝重量饿小白鼠肝糖原克%＝B/C×0.3×1/1000×(10＋肝重量)/1×100/肝重量思考题

肝糖原的合成与分解是如何进行的？

实验十九：乳酸脱氢酶活力测定

目的要求

(1) 掌握LDH活性测定原理； (2) 学习用比色法测定酶活性的方法。

实验原理

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。

LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位。定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。

利用上述原理，改变不同第五则可测定相应脱氢酶反应过程中A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等，适用范围很广。

试剂和器材

一、试剂

1、50m mol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液母液：

A: 50 m mol/L K2HPO4: 称K2HPO41.74g加蒸馏水溶解后定容至200ml。 B: 50 m mol/L KH2PO4: 称KH2PO43.40g加蒸馏水溶解后定容至500ml。取溶液A 31.5ml ＋溶液B 68.5ml, 调节pH至6.5。置4℃冰箱备用。

2、10m mol/L pH 6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液用上述母液稀释得到。现用现配。 3、0.1mol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液, 用上述母液稀释得到。现用现配。

4、NADH溶液：称3.5mg纯NADH置试管中，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液1ml 摇匀。现用现配。

5、丙酮酸溶液：称2.5mg丙酮酸钠，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液29ml, 使其完全溶解。现用现配试剂。二、

材料

动物肌肉、肝、心、肾等组织。三、

器材

组织捣碎机，紫外分光光度计，恒温水浴，移液管(5ml, 0.1ml), 微量注射器（10ul）。

操作方法

一、

制备肌肉匀浆

称取20g 兔肉, 按W/V=1/4比例加入4℃预冷的10m mol/L Ph6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆液倒入烧杯中，置4℃冰箱中提取过夜，过滤后得到组织提取液。二、

LDH活力测定

试验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。取2只石英比色杯，在1只比色杯中加入0.1m mol/L pH 7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零；另一只比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml, NADH溶液0.1ml，加盖摇匀后，测定340 nm光吸收值（A）。取出比色杯加入经稀释的酶液10μl，立即计时，摇匀后，每隔0.5min 测A340nm，连续

测定3min，以 A对时间作图，取反应最初线性部分，计算A340nm/min减少值。加入酶液的稀释度（或加入量）应控制 A340nm/min下降值在0.1－0.2之间。三、

数据处理

计算每毫升组织提取液中LDH活力单位：

LDH活力单位（U）/mL 提取液＝

提取液中LDH总活力单位＝LDH活力（U）/ml  总体积

注意事项

（1）实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，则应贮存在－20℃冰箱。

（2）酶液的稀释度及加入量应控制A340nm/min下降值在0.1－0.2之间，以减少实验误差。（3）NADH溶液应在临用前配制。思考题：

1. 简述用紫外分光光度法测定以NAD+为辅酶的各种脱氢酶测定原理。

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