对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的测定方法[

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105181859 A (43)申请公布日 2015.12.23

(21)申请号 201510654522.8(22)申请日 2015.10.12

(71)申请人南京天翔医药科技有限公司

地址210012 江苏省南京市长虹路439号15

栋三楼(72)发明人胡长花 张爱琴 李正海 赵国新

潘娜娜(74)专利代理机构北京精金石专利代理事务所

(普通合伙) 11470

代理人强红刚(51)Int.Cl.

G01N 30/34(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图9页

(54)发明名称

对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的测定方法(57)摘要

本发明公开了一种对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，该方法采用高效液相色谱法，流动相为含离子对的磷酸盐缓冲液及有机溶剂，采用梯度洗脱法。本发明可用于对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸的含量检测以及半胱氨酸降解产物胱氨酸的含量控制，以及盐酸半胱氨酸原料的含量测定，并且半胱氨酸与胱氨酸有较好的分离度，专属性强，灵敏度高，操作简便。

C N 1 0 5 1 8 1 8 5 9 A CN 105181859 A

权 利 要 求 书

1/1页

1.一种对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，按以下流动相条件进行梯度洗脱：流动相A为含离子对的磷酸盐溶液，用磷酸调节pH＝3.5-5.0；流动相B为甲醇；按体积比计流动相的梯度设置如下：

时间(min)流动相A0～1011～2021～40

96～9920～9080～100

流动相B1～410～800～20

所述的离子对在溶液中的浓度为0.2～20mmol/L，所述的磷酸盐在溶液中的浓度为0.2～20mmol/L。

2.根据权利要求1所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其特征在于，按体积比计流动相的梯度设置如下：

时间(min)流动相A0～1011～2021～40

985098

流动相B2502

所述的离子对在溶液中的浓度为2～5mmol/L；所述的磷酸盐在溶液中的浓度为1～5mmol/L。

3.根据权利要求1所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其特征在于，所述的离子对选自如下的一种或两种以上：己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠；所述的磷酸盐选自磷酸二氢钾或/和磷酸二氢钠。

4.根据权利要求3所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其特征在于，所述的离子对为己烷磺酸钠；所述的磷酸盐为磷酸二氢钾。

5.根据权利要求1-4任一项所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱或辛烷基硅烷键合硅胶柱。

6.根据权利要求1-4任一项所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的检测波长为200～230nm。

7.根据权利要求6所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的检测波长为205nm。

8.根据权利要求1-4任一项所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其特征在于，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃，检测波长为220nm。

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说 明 书

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对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的

测定方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及对乙酰氨基酚注射液的分析方法，具体涉及

对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的测定方法。

[0001]

背景技术

对乙酰氨基酚用于发热，也可用于缓解轻中度疼痛，如头痛、肌肉痛、关节痛以及

神经痛、痛经、癌性痛和手术后止痛等。本品可用于对阿司匹林过敏或不能耐受的患者。[0003] 对乙酰氨基酚注射液的处方中采用盐酸半胱氨酸为抗氧剂，盐酸半胱氨酸的毒性小，本身不易变色，而且有一定的助溶作用，可以改善溶液的颜色和澄明度，但是盐酸半胱氨酸极易被氧化，生成氧化降解杂质胱氨酸，上述两种物质在制剂中的含量均需进行控制。针对这样的需求，研究并开发一种对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的测定方法，这显得尤为重要。[0004] 中国药典2010年版、美国药典(USP35-NF30)及EP8.0中盐酸半胱氨酸原料含量测定方法均采用滴定法，但对乙酰氨基酚注射液为注射液，成分较复杂，且作为附加剂的半胱氨酸含量较低，滴定过程中指示剂加入量、指示终点与等当量间、操作者对颜色判断等，容易造成较大误差，因此该方法影响对产品的质量控制而不适用。[0005] 另外，常用的衍生化方法样品配制过程较复杂，且重复性较差。再者，中国药典2010年版和美国药典(USP35-NF30)有关物质采用薄层色谱法，但该方法灵敏度低，准确度低，不能对半胱氨酸及其降解产物进行定量测定，仅能作为限度检查。EP8.0中半胱氨酸有关物质方法采用氨基酸分析仪，该仪器价格较昂贵，专属性强，大部分厂家并不具备。

[0002]

发明内容

为了解决对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的分析方法的问题，本发明人通过大量试验摸索了该制剂的质量控制方法，最终以含离子对的磷酸盐缓冲液及甲醇为流动相，采用梯度洗脱的方法成功分离盐酸半胱氨酸与杂质，并严格进行方法验证，保证方法的科学严谨，满足了研发和生产的需求。[0007] 因此，本发明的目的在于提供一种对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，该方法适用于乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及其降解产物胱氨酸的分离及定量检测。[0008] 具体地，实现本发明目的的具体技术方案概况如下：

[0009] 一种对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其采用高效液相色谱法，按以下流动相条件进行梯度洗脱：流动相A为含离子对的磷酸盐溶液，用磷酸调节pH＝3.5-5.0；流动相B为甲醇；按体积比计流动相的梯度设置如下：

[0006] [0010]

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说 明 书

时间(min)流动相A0～1011～2021～40

96～9920～9080～100

流动相B1～410～800～20

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所述的离子对在溶液中的浓度为0.2～20mmol/L，所述的磷酸盐在溶液中的浓度为0.2～20mmol/L。[0012] 优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，按体积比计流动相的梯度设置如下：

[0011] [0013]

时间(min)流动相A0～1011～2021～40

[0014]

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流动相B2502

所述的离子对在溶液中的浓度为2～5mmol/L；所述的磷酸盐在溶液中的浓度为1～5mmol/L。[0015] 优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，所述的离子对选自如下的一种或两种以上：己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠；所述的磷酸盐选自磷酸二氢钾或/和磷酸二氢钠。[0016] 进一步优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，所述的离子对为己烷磺酸钠；所述的磷酸盐为磷酸二氢钾。[0017] 再进一步优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，所述高效液相色谱法的色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱或辛烷基硅烷键合硅胶柱。

再进一步优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨

酸的检测方法，所述高效液相色谱法的检测波长为200～230nm。[0019] 再进一步优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，所述高效液相色谱法的检测波长为205nm。[0020] 在本发明的一个最优选的实施例中，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其中色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃，进样量为20μl，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，按体积比计流动相的梯度设置如下：

[0018] [0021]

时间(min)流动相A

流动相B

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0～1011～2021～40

[0022]

说 明 书

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与现有技术相比，本发明方法具有如下有益效果：[0023] (1)与薄层色谱法比较，本发明的方法可实现对盐酸半胱氨酸的定量测定，能有效控制盐酸半胱氨酸氧化降解产生的胱氨酸的含量，远远优于药典的薄层色谱法。[0024] (2)与滴定法相比较，本发明的方法没有因操作及主观判断产生的误差，且能将降解产物胱氨酸进行定量检测，其它物质对半胱氨酸的干扰也较小，准确度高。[0025] (3)与采用氨基酸分析仪的方法比较，本发明的方法在普通高效液相色谱仪及紫外检测器基础上，采用普通的色谱柱，辅之以梯度洗脱方法，灵敏度较高，分离度和准确度均较佳，且本法较氨基酸分析仪的检测成本低，更加适用于常规的盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测。[0026] 总之，本发明可用于对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸的含量检测以及半胱氨酸降解产物胱氨酸的含量控制，以及盐酸半胱氨酸原料的含量测定，并且半胱氨酸与胱氨酸有较好的分离度，专属性强，灵敏度高，操作简便。附图说明：[0027] 图1：半胱氨酸定位； 图2：胱氨酸定位；[0028] 图3：样品； 图4：胱氨酸和半胱氨酸分离度；[0029] 图5：半胱氨酸原料酸破坏； 图6：半胱氨酸原料碱破坏；[0030] 图7：半胱氨酸原料氧化破坏； 图8：半胱氨酸原料高温破坏；[0031] 图9：半胱氨酸原料光照破坏； 图10：样品酸破坏；[0032] 图11：样品碱破坏； 图12：样品氧化破坏；[0033] 图13：样品高温破坏； 图14：样品光照破坏；[0034] 图15：样品检验-1403161批； 图16：样品检验-1403171批；[0035] 图17：样品检验-1403181批。具体实施方式

[0036] 以下通过实施例形式，对本发明涉及的对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。[0037] 实施例一、盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的分析方法的开发[0038] 为控制产品的质量，抗氧剂含量是注射液中比较重要的指标，对于盐酸半胱氨酸的含量检测已有较多标准及文献的方法，但是对于对乙酰氨基酚注射液中的盐酸半胱氨酸及其降解产物胱氨酸的检测并不适用，对此，我们展开了注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的的检测方法的研究和探索。

[0039] 盐酸半胱氨酸的检测方法有滴定法、UV法及HPLC法等，我们采用HPLC法建立本

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说 明 书

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品中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法。[0040] 色谱条件：Agilent1100系列HPLC仪，试验采用色谱柱为CHROMASIL C18(250mm×4.6mm，5μm)，以磷酸盐缓冲液[取己烷磺酸钠0.5g，磷酸二氢钾0.2g，加水1000ml溶解，并用磷酸调节pH为4.0]为流动相A；甲醇为流动相B，梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为25℃；检测波长为205nm；进样量为20μl。[0041] 梯度洗脱：甲醇与磷酸缓冲盐溶液的体积比例为：0-10分钟时，2：98；11-20分钟时，50：50；21-40分钟时，2：98。[0042] 流动相的筛选：对乙酰氨基酚注射液中含有主药对乙酰氨基酚、辅料盐酸半胱氨酸及其它辅料，流动相的选择主要考虑对乙酰氨基酚及其他辅料与胱氨酸和盐酸半胱氨酸的分离效果，本发明人采用了各种不同的流动相后的具体试验结果如下：[0043] 1、采用磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，盐酸半胱氨酸几乎无保留，出峰较早，逐级降低乙腈比例至0％，保留时间无明显延迟，且与其它辅料峰及降解产物分离度较小，并不适用。

[0044] 2、采用磷酸盐缓冲液(含四丁基氢氧化铵)-乙腈(92：8)，盐酸半胱氨酸几乎无保留，逐级降低甲醇比例至10％、5％、0％，盐酸半胱氨酸仍出峰较早，保留时间无明显延迟现象，与其它辅料峰及降解产物分离度较小，并不适用。[0045] 3、以醋酸铵溶液-甲醇(85：15)为流动相，盐酸半胱氨酸几乎无保留，逐级降低甲醇比例至10％、5％、0％，盐酸半胱氨酸仍出峰较早，保留时间无明显延迟现象，与其它辅料峰及降解产物分离度较小，并不适用。[0046] 4、以磷酸盐缓冲液(取庚烷磺酸钠5g和磷酸二氢钾3g，加水溶解并稀释至500ml，用磷酸调节pH值至4.0)-甲醇(98:2)为流动相时，半胱氨酸保留时间约为7min，空白辅料无影响，但是样品中有杂质峰和半胱氨酸分不开，且流动相中盐浓度较高，易损伤色谱柱，拟降低盐浓度试验。[0047] 5、以磷酸盐缓冲液(取庚烷磺酸钠1.02g和磷酸二氢钾0.68g，加水溶解并稀释至500ml，用磷酸调节pH值至4.0)-甲醇(98:2)为流动相，半胱氨酸与杂质峰分离度仍较差。更换离子对试剂为己烷磺酸钠。[0048] 6、当采用磷酸盐缓冲液(取己烷磺酸钠0.5g，磷酸二氢钾0.2g，加水1000ml溶解，并用磷酸调节pH为4.0)-甲醇(80～95：5～20)为流动相时，盐酸半胱氨酸和胱氨酸分离度较差，且出峰较早；将流动相比例调节为磷酸盐缓冲液(取己烷磺酸钠0.5g，磷酸二氢钾0.2g，加水1000ml溶解，并用磷酸调节pH为4.0)-甲醇(98：2)时，胱氨酸和盐酸半胱氨酸保留时间在3min之后，两峰和主峰及其它峰的分离度均大于1.5，且峰形较好。故选用磷酸盐缓冲液(取己烷磺酸钠0.5g，磷酸二氢钾0.2g，加水1000ml溶解，并用磷酸调节pH为4.0)-甲醇(96～99：1～4，优选为98:2)为初始流动相。[0049] 检测波长的选择：分别将0.2mg/ml的盐酸半胱氨酸和胱氨酸在200～400nm波长范围进行紫外扫描，结果两者均为末端吸收，故选用205nm作为测定波长。[0050] 在上述研究的基础上，我们采用选定的色谱条件进行系统适用性试验，由色谱图可知，空白溶剂及辅料峰保留时间在2.5min之前，对乙酰氨基酚峰在15min左右，不干扰半胱氨酸的测定。分别注入半胱氨酸对照品及胱氨酸对照品及样品供试液，记录色谱图。半胱氨酸保留时间为4.6min，胱氨酸保留时间为3.8min，两者分离度为2.6。供试品溶液色谱

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说 明 书

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图中，盐酸半胱氨酸与胱氨酸的分离度、半胱氨酸与主药的分离度均大于2(见图1～4)。[0051] 实施例二、盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的分析方法的验证[0052] 对上述拟选用的方法进行专属性考察，按照药物质量标准分析方法验证指导原则分别进行了如下试验：(1)酸破坏：分别取盐酸半胱氨酸0.25mg/ml及样品10ml，加1mol/L盐酸溶液2ml，室温放置2h。(2)碱破坏：分别取盐酸半胱氨酸0.25mg/ml及样品10ml，加1mol/L氢氧化钠溶液2ml，室温放置2h。(3)氧化破坏：分别取盐酸半胱氨酸0.25mg/ml及样品10ml，加30％双氧水2ml。(4)高温破坏：分别取盐酸半胱氨酸0.25mg/ml及样品10ml，80℃条件下放置4h。(5)光照破坏：分别取盐酸半胱氨酸0.25mg/ml及样品10ml，置照度为4500LX照度下放置6小时。[0053] 取上述5种破坏溶液，在上述色谱条件下进样，检测半胱氨酸是否有明显降解，以降解产物峰和半胱氨酸峰分离度大于1.5为合格标准的判断依据(见图5～14)。[0054] 采用上述检测方法发现，经过破坏试验的样品中半胱氨酸均有不同程度的降解，并均降解成胱氨酸，作为离半胱氨酸最近的杂质，半胱氨酸和胱氨酸的分离度均大于1.5，分离度良好，表明本法专属性较好。

[0055] 我们进一步对该法进行了以下研究，结果如下：[0056] 1、线性范围[0057] 结果表明：盐酸半胱氨酸在1～500μg/ml浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。胱氨酸在1～500μg/ml浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。[0058] 2、精密度试验

[0059] 取浓度约为0.25mg/ml的半胱氨酸和胱氨酸混合溶液，连续进样6次，其峰面积的相对标准偏差，半胱氨酸为0.89％，胱氨酸为0.62％。[0060] 3、灵敏度

[0061] 取半胱氨酸及胱氨酸的对照品溶液，逐级稀释，以信噪比为3时所对应的浓度为检测限，信噪比为10时为定量限，半胱氨酸的检测灵敏度为0.3μg/ml，胱氨酸的检测灵敏度为0.6μg/ml。[0062] 4、重复性试验

[0063] 取同一批对乙酰氨基酚注射液样品6份，照上述方法测定其半胱氨酸含量，结果6份样品含量的相对标准偏差为0.35％，精密度较好。[0064] 5、回收率

[0065] 采用往处方量辅料及主药中加入半胱氨酸及胱氨酸对照品的方法，考察上述方法的准确度，结果半胱氨酸平均回收率为98.84％，相对标准偏差为1.2％，胱氨酸平均回收率为99.35％，相对标准偏差为0.96％，准确度较好。[0066] 6、溶液稳定性

[0067] 取供试品溶液分别在常温和低温条件下于0、2、4、6、8小时进样，结果半胱氨酸在常温下氧化降解较快，非常不稳定，在低温条件下在8小时内峰面积保持稳定，相对标准偏差为1.8％，故本品常温下需现配现用，或低温保存，8小时内使用。通过上述方法验证，我们确定该色谱条件准确度及精密度等均较好，对本品三批样品进行半胱氨酸及降解产物胱氨酸的测定，结果如下(见图15～17)：

[0068] [0069]

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说 明 书

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本发明的有益效果为：[0071] 1、与薄层色谱法比较，本发明的方法可实现对盐酸半胱氨酸的定量测定，能有效控制盐酸半胱氨酸氧化降解产生的胱氨酸的含量，远远优于药典的薄层色谱法。[0072] 2、与滴定法相比较，本法没有因操作及主观判断产生的误差，且能将降解产物胱氨酸进行定量检测，其它物质对半胱氨酸的干扰也较小，准确度高。[0073] 3、与采用氨基酸分析仪的方法比较，本方法在普通高效液相色谱仪及紫外检测器基础上，采用普通的色谱柱，辅之以梯度洗脱方法，灵敏度较高，分离度和准确度均较佳，且本法较氨基酸分析仪的检测成本低，更加适用于常规的盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测。

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