线粒体DNA提取

(1)将待测组织充分切碎(碎片大小:脾脏组织≤10 mg、其他组织≤25 mg),取样品25 mg移入微型离心管。

(2)加入180 μL Buffer ATL、20 μL Proteinase K、缓慢充分混匀,置于56 ℃恒温水浴直到完全溶解(水浴期间间隔摇晃混合)。在开始下一步前摇晃混合15 s。

(3)加入200μL Buffer AL,充分混合(血液样品需56℃恒温水浴10 min)。

(4)加入200 μL 无水乙醇,混合均匀。

(5)将混合溶液移至2mL收集管中的滤管里,6000 xg条件离心1 min,取出滤管,扔掉收集管。

(6)将滤管放入新的收集管中,加入500 μL Buffer AW1, 6000 xg条件离心1 min,取出滤管,扔掉收集管。

(7)将滤管放入新的收集管中,加入500 μL Buffer AW2, 20000 xg条件离心3 min,取出滤管,扔掉收集管。

(8)将滤管放入新的微型离心管(1.5-2 mL)。

(9)向滤管中心滴加200 μL(100 μL)Buffer AE洗涤DNA,室温放置1 min。6000 xg条件离心1 min。

(10)重复一边上述步骤,增大DNA产率(重复一遍即可)。理论25mg原料大概能提取10-20μg DNA.

注:摇晃混合和拿起时一定要轻慢,防止DNA断裂。

琼脂糖电泳步骤

1. 准备电泳槽:将有机玻璃的电泳凝胶床洗净晾干,插上样品梳。

2. 琼脂糖凝胶的制备:称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中(1%的琼脂糖含量),置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化(不要加热至沸腾),取出摇匀。

3. 灌胶:将冷却60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上(厚度不超过0.5cm)。待琼脂糖胶凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,然后拔出梳子。

5. 加样:将DNA样品与加样缓冲液按5:1混匀后(取10μL DNA样液与2μL 电泳载样缓或5μL DNA样液与1μL 电泳载样缓冲液混匀,用移液枪将混合液加到样品槽中,每槽加10-20μL,记录样品的点样次序和加样量。

6. 电泳:安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至80V(4V·cm-1),电泳2h,当移到距凝胶前沿1-2cm时,停止电泳。

7. 染色和观察:取出凝胶,放在260nm的紫外灯下观察,有橙红色荧光条带的位置,即为DNA条带,或在紫外灯下照相记录电泳图谱。

短期贮存:

4℃或-20℃存放于TE(Tris和EDTA)缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关,PH为8时,可减少DNA脱氨反应,PH低于7.0时DNA容易变性。

长期贮存:

TE缓冲液中-70℃保存数年;在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。