．， … ／～．… ．。 ；ｈｔｔｐ：／／ｘｂｙｘ．ｘｙｓｍ．ｎｅｔ １１４１ 小分子ＲＮＡ干扰组织因子在新生猪胰岛细胞中的表达 暨明 ，易受南 ，于德玲 ，王维 （１．中南大学基础医学院生理学系，长沙４１００７８；２．中南大学湘雅三医院 细胞移植与基因治疗中心，长沙４１００１３；３．澳大利亚悉尼大学 Ｗｅｓｔｍｅａｄ医院移植与肾病研究中心，悉尼２１４５，澳大利亚） ［摘要］ 目的：利用小分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）在基因水平对新生猪胰岛细胞进行修饰，抑制细胞组织因子的 表达。方法：设计５对ｓｉＲＮＡ转染新生猪胰岛细胞，用ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法筛选组织因子基因沉默效果最好的 ｓｉＲＮＡ或组合，同时流式细胞仪检测ｓｉＲＮＡ转染对细胞活性的影响，ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ和流式细胞仪分别检测细 胞组织因子的基因及蛋白沉默水平。结果：根据ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ结果筛选出组织因子基因沉默效果最好的３对 ｓｉＲＮＡ组合，转染新生猪胰岛细胞后，ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ及流式细胞仪检测新生猪胰岛细胞组织因子的基因沉默 效率达６０％，蛋白表达水平降低约５０％，同时流式细胞仪检测结果提示ｓｉＲＮＡ转染对新生猪胰岛细胞的活性 没有明显的影响。结论：３对ｓｉＲＮＡ组合在体外特异性抑制新生猪胰岛细胞组织因子的表达。 ［关键词］ ｓｉＲＮＡ； 组织因子； 新生猪胰岛细胞 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｉ．ｉｓｓｎ．１６７２－７３４７．２０１ １．１２．００３ ｓｉＲＮＡ．ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｉｎ ｐｏｒｃｉ０ｒｃｌｎｅ ｎｅｏｎａｔａｌｎｅ Ｂｅｏｎａｔａｌ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｃｌｕｓｔｅｒｓ’ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｔｒｏＪＩ Ｍｉｎｇ ，ＹＩ Ｓｈｏｕｎａｎ ，ＹＵ Ｄｅｌｉｎｇ ，ＷＡＮＧ Ｗｅｉ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｆＢａｓｏｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００７８，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｘｉａｎｇｙａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００１３，Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔｍｅａｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｙｄｎｅｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｙｄｎｅｙ ２１４５，Ａｕｓｔｒａｌｉａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｃｌｕｓｔｅｒｓ（ＮＩＣＣ）ｂｙ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）一ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ（ＴＦ）ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｏｒｃｉｎｅ ＮＩＣＣ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ５ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｏｒ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＮＩＣＣ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｆｏｒ ＴＦ ｇｅｎｅ ｂｖ ｒｅ— ａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ ｗｈｉｃｈ ｗｏｒｋｅｄ ｂｅｓｔ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＮＩＣＣ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ＴＦ ｓｉＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ＦＡＣＳ．Ｔｈｅ ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＴＦ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｆｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ａｎｄ ＦＡＣＳ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ＦＡＣＳ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａ ６０％ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＴＦ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａ ５０％ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｉｅｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＴＦ ｏｎ ＮＩＣＣ ｗｅｒｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ ３ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｉＲＮＡ．Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇ． ｎｉｉｆｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＮＩＣＣ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＦＡＣＳ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 收稿日期（Ｄａｔｅ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｉｏｎ）２０１１—０３—３１ 作者简介（Ｂｉｏｇｒａｐｈｙ） 暨明，硕士，讲师，主要从事移植与血液免疫研究。 通信作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒｓ） 于德玲，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｅｌｉｎｇ＿ｙｕ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ；３￣维，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｗｅ０１ｃｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｎ．ｃｎ 基金项目（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｔｅｍ）国家自然科学基金（３０９００３５９）。Ｃｈｉｎａ（３０９００３５９）． Ｔｈｉｓｗｏｒｋ ｗａｓ ｓｕｐｐｏ￣ｅｄ ｂｙｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ 中南大学学报（医学版），２０１１，３６（１２）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｕｍｅｄ．ｏｒｇ；ｈｔｔｐ：／／ｘｂｙｘ．ｘｙｓｍ．ｎｅｔ ０ｆ ＴＦ ｏｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ＮＩＣＣ ｉｓ ｅｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ３ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．ｆ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ； ｎｅｏｎａｔａｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｃｌｕｓｔｅｒ 无论是同种还是异种胰岛经门静脉移植，都面 临着移植后早期快速的大量胰岛丢失的问题 。 在移植过程中，注入门静脉的胰岛与血液接触后会 发生一种凝血／炎症反应过程，称之为立即经血液 介导的炎症反应（ｉｎｓｔａｎｔ ｂｌｏｏｄ．ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏ— ｒｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＩＢＭＩＲ）。ＩＢＭＩＲ以凝血和补体系统的 快速激活，胰岛内白细胞的募集和渗入，血小板的 快速激活并黏合在胰岛表面为特征，胰岛表面血凝 块迅速形成并将胰岛包裹，胰岛形态随之被浸润的 白细胞破坏 。因此，ＩＢＭＩＲ不仅被认为是在胰 岛移植后造成早期大量胰岛丢失的主要原因，是胰 岛成功移植的重要障碍之一，而且也是门静脉血栓 形成的关键因素 ＇ 。 。研究 发现：胰岛细胞 能表达组织因子（ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ，ＴＦ），并认为表达在 胰岛细胞上的ＴＦ是触发ＩＢＭＩＲ的主要因素。因 此，本研究拟用ｓｉＲＮＡ对新生猪胰岛细胞（ｎｅｏｎａｔａｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｃｌｕｓｔｅｒｓ，ＮＩＣＣ）的ＴＦ目标基因进行 特异性地表达沉默，以期直接分析ＴＦ对ＮＩＣＣ与 血液接触后发生的ＩＢＭＩＲ的始动作用，探寻一种 更为安全有效的措施来抑制ＩＢＭＩＲ，减少胰岛的丢 失，提高胰岛的植入率。 １材料与方法 １．１试剂与动物 １．１．１ 细胞生物学试剂 Ｈａｍ’Ｓ ＦＩＯ ｍｅｄｉｕｍ、Ｈａｎｋ’Ｓ平衡盐溶液、 一谷氨 酰胺、青霉素、链霉素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’Ｓ Ｓｔｅａｌｔｈ 。‘。ＲＮＡｉ、 ＢＬＯＣＫ—ｉＴ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｏｌｉｇｏ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｓｕ— ｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ—ＵＤＧ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 均为美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；ｎｏｎｓｐｅｃｉｉｆｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲ－ ＮＡ购自美国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司，胶原酶 Ｖ、异丁基甲基黄嘌呤（ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ＩＢ－ ＭＸ）、烟碱、牛血清白蛋白、葡萄糖、羊ＩｇＧ、ＦＩＴＣ标 记驴抗羊抗体均为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ为美国Ｑｉａｇｅｎ公司产品，羊抗人ＴＦ抗体购 自加拿大Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ公司；Ａｃｃｕｔａｓｅ购自美国 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ为美国ＢＤ Ｂｉ－ ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司产品；猪血清自备。 １．１．２实验动物 １～３ ｄ新生Ｗｅｓｔｒａｎ猪，雌雄不限，１．２～１．８ ｋｇ，购自澳洲新南威尔士州当地农场。悉尼西区动 物伦理委员会批准通过该动物研究项目。 １．２ 方法 １．２．１ ＴＦ ｓｉＲＮＡ和引物设计 参照Ｐｕｂｍｅｄ收录的ｐｏｒｃｉｎｅ ＴＦ序列（ＡＹ５０４４２４）， 应用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＬＯＣＫ—ｉＴ删ＲＮＡｉ设计软件设计５条 ＴＦ ｓｉＲＮＡ，自行设计互补引物（表１）。 表１ ｓｉＲＮＡ和引物序列 Ｔａｂ．１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ １．２．２ ＮＩＣＣ的分离和培养 猪胰岛的分离参考文献［１３］。动物麻醉后，心 脏放血致死，取出胰岛，将其剪碎成１～２ ｍｍ。。加 入２．５ ｍｇ／ｍＬ胶原酶Ｖ，在３７℃水浴中震摇１０～１２ ｍｉｎ进行组织消化后，立即加入含１０％血清的 Ｈａｎｋ’Ｓ平衡盐溶液终止酶的作用，随即用５００ ｔｘｍ筛 网过滤消化后的组织。Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐溶液洗涤３次 后，用Ｈａｍ’Ｓ Ｆ１０ ｍｅｄｉｕｍ重悬ＮＩＣＣ，种植于直径为 １４ ｍｍ培养皿中，于３７℃，５％ＣＯ 饱和湿度的ＣＯ 培养箱中培养。ＮＩＣＣ分离后，于培养的第１，３天更 换培养基。 １．２．３ ｓｉＲＮＡ转染 收集培养３ ｄ的ＮＩＣＣ，ＰＢＳ洗涤１次后计数胰 小分子ＲＮＡ干扰组织因子在新生猪胰岛细胞中的表达暨明，等 岛当量（ｓｔａｎｄａｒｄ ｉｓｌｅｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ，ＩＥＱｓ），加入Ａｃ— ｅｕｔａｓｅ将细胞团裂解为单个细胞，用不含血清和抗生 素的Ｈａｍ’Ｓ ＦＩＯ ｍｅｄｉｕｍ重悬细胞后进行ｓｉＲＮＡ转 ２ 结 果 染。首先用不同浓度的荧光素（ＦＩＴＣ）标记的ｄｓＲ— ＮＡ ｏｌｉｇｏｍｅｒ－ＢＬＯＣＫ—ｉＴ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｏｌｉｇｏ（５０，１００， ２．１ ＮＩＣＣ的培养 倒置显微镜下，培养１～３ ｄ的胰岛细胞聚集成 团，有明显的包膜，类似胚胎干细胞样的集落，呈暗 １５０，２００ ｎｍｏｌ／Ｌ）分别和１０ 的脂质体ｌｉｐｏ－ ｆｅｅｔａｍｉｎｅ ２０００转染经酶消化分离的２×１０。个细胞。 转染后２４ ｈ收集细胞，经流式细胞仪检测ＦＩＴＣ阳性 细胞的百分率。ＦＩＴＣ阳性细胞的百分率可以反应 黄色半透明类圆形细胞，胞浆丰富，边缘清晰，细胞 团边缘有包膜。细胞团大都悬浮于培养基中，少数 松散贴壁，部分细胞团周围有少量细胞悬浮附着生 细胞转染的效率。通过改变细胞浓度、ｓｉＲＮＡ和 ｌｉｐｏｆｅｅｔａｍｉｎｅ的比例以得到最佳的转染条件。 １．２．４ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测ＮＩＣＣ ＴＦ基因表达水平 ｓｉＲＮＡ转染后３６ ｈ收集细胞，参照ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｆ说明书提取细胞总ＲＮＡ后并测量ＲＮＡ浓度。取 １ Ｉｘｇ ＲＮＡ用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ合成ｃＤＮＡ，然后取１ Ｌ ｃＤＮＡ作为模板，加入至 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ—－ＵＤＧ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓ—・ ｔｅｒ Ｍｉｘ的２０ 体系中，整个体系置于Ｒｏｔｏｇｅｎｅ一 ３０００ Ｒｅａ１．Ｔｉｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ进行实时定量ＰＣＲ（相 应引物的序列见表１）。扩增反应的条件如下：９５ ｃ《二 预变性２ ｍｉｎ，然后９５℃变性４０ Ｓ，６０ ｏＣ退火３０ Ｓ， ７１℃延伸３０ Ｓ，４５个循环。以猪Ｂ—ａｃｔｉｎ作为内源性 ＲＮＡ对照，所有ＰＣＲ反应结果由Ｒｏｔｏｒ—ｇｅｎｅ ３０００软 件进行分析。 １．２．５ 流式细胞仪检测ｓｉＲＮＡ转染后ＮＩＣＣ的活性 收集ｓｉＲＮＡ转染７２ ｈ后的细胞，１００ ＩｘＬ ＰＥ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ结合缓冲液重悬细胞，加入５ Ｌ ＰＥ Ａｎ— ｎｅｘｉｎ Ｖ和５ ７一乙酰乙酸脱羧酶（７－ＡＡＤ），室温下 避光孵育１５ ｍｉｎ后，即上机（ＬＳＲ ＩＩ流式细胞仪）检 测，ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ软件分析处理实验数据。设门去除细 胞碎片而选择所有细胞进行分析，Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ和７一 ＡＡＤ双阴性细胞即为活细胞。 １．２．６ 流式细胞仪检测ＮＩＣＣ ＴＦ蛋白表达水平 ｓｉＲＮＡ转染后７２ ｈ收集细胞，加羊抗人ＴＦ抗体 （文献［１４］报道该抗体与猪ＴＦ有交叉反应）或羊 ＩｇＧ冰上孵育３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤２次后，加入ＦＩＴＣ标 记的驴抗羊ＩｇＧ，冰上孵育３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤２次后， 流式细胞仪检测ＦＩＴＣ阳性细胞的百分率，即ＮＩＣＣ 蛋白表达水平。 １．３统计学处理 采用ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ软件分析处理实验数据，实验结 果以均数－４－标准差（ ±Ｓ）表示，多组问比较用单因 素方差分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 长，随着培养时间延长，附着的细胞脱落，包膜更为 光滑完整（图１）。 ２．２脂质体介导的ｓｉＲＮＡ转染ＮＩＣＣ的效率 ５０，１００，１５０，２００ ｎｍｏｌ／Ｌ ｓｉＲＮＡ转染后收集的细 胞经流式细胞仪检测，ＦＩＴＣ阳性细胞的百分率分别 为３２．５％，５３．３％，７５．０％和６９．３％（图２）。因此， 最佳转染条件是：ｓｉＲＮＡ的浓度为１５０ ｎｍｏｌ／Ｌ，与１０ 的脂质体ｌｉｐｏｆｅｅｔａｍｉｎｅ ２０００转染２×１０。个细胞， 转染效率最高可达７５．０％［（６７．２±８．５）％，ｎ＝４］。 ２．３ ＮＩＣＣ ＴＦ基因表达水平的检测 ５条ＴＦ ｓｉＲＮＡ单独或两两组合或三三组合按上 述最佳转染条件分别转染ＮＩＣＣ，转染３６ ｈ后收集细 胞提取总ＲＮＡ，反转录为ｃＤＮＡ后ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ检 测＂基因表达水平。结果显示：ｓｉＲＮＡ５， ｓｉＲＮＡ（１＋２），ｓｉＲＮＡ（１＋２＋４）和ｓｉＲＮＡ（１＋２＋５） 转染后，细胞 基因表达量比未转染的ＮＩＣＣ（ｎａ— ｉｖｅ ＮＩＣＣ） 表达量有明显减少（Ｐ＜０．０１，／２＝３；图 ３）。根据干扰的基因序列位点，选择基因沉默效率 最高的ｓｉＲＮＡ（１＋２＋５）用于以后实验的细胞 基 因沉默，其基因沉默效率为５３％～７０％，平均６０％ （Ｐ＜０．０１，ｎ＝５；图３）。 ２．４转染后ＮＩＣＣ的活性检测 收集转染后７２ ｈ的ＮＩＣＣ，经Ａｃｃｕｔａｓｅ酶处理消 化成单细胞后，加入ＰＥ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ和７－ＡＡＤ检测细 胞活性。ＰＥ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ阳性细胞为凋亡细胞（右下 区域），７－ＡＡＤ阳性细胞为死亡细胞（左上区域），ＰＥ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ和７－ＡＡＤ双阳性细胞为晚期凋亡细胞和 死亡细胞（右上区域），ＰＥ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ和７－ＡＡＤ双阴 性细胞为活细胞（左下区域）。结果显示：对照的 ｓｉＲＮＡ和ＴＦ ｓｉＲＮＡ转染后的ＮＩＣＣ活细胞百分率分 别为（７４．９±１．７）％和（７４．６±１．４）％，差异无统计 学意义（Ｐ＞０．０５，ｎ＝４；图４）。可见ｓｉＲＮＡ对细胞 活性没有明显的影响。 １１４６ 中南大学学报（医学版），２０１１，３６（１２）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｕｍｅｄ．ｏｒｇ；ｈｔｔｐ：／／ｘｂｙｘ．ｘｙｓｍ．ｎｅｔ ＩＢＭＩＲ中的作用。 本研究运用ｓｉＲＮＡ在基因水平上阻断ＮＩＣＣ ＴＦ 的表达，以抑制ＮＩＣＣ与血液接触后触发的ＩＢＭＩＲ， 从而减少ＮＩＣＣ的丢失。实验设计了５条ｓｉＲＮＡ， 单独或两两组合或三三组合按最佳转染条件分另０转 染ＮＩＣＣ，结果发现其中３条ｓｉＲＮＡ组合可以使 ＮＩＣＣ的 基因沉默效率达５３％～７０％，且ＴＦ蛋 白表达水平下降近５０％；同时流式细胞仪检测结果 显示：ｓｉＲＮＡ转染后，ＮＩＣＣ的活性未受明显的影响， 排除了因细胞死亡所导致ＮＩＣＣ蛋白表达水平的降 低。上述结果提示：设计的５条ｓｉＲＮＡ中有３条 ｓｉＲＮＡ组合可显著降低ＮＩＣＣ在基因及蛋白水平ＴＦ 的表达，为进一步研究ＴＦ在ＩＢＭＩＲ发生中的作用 提供了可能。后续的实验将包括体外实验—— ＮＩＣＣ和人血液供体孵育的Ｌｏｏｐｓ ｍｏｄｅｌ以及体内实 验——ＮＩｃｃ经小鼠门静脉的移植，观察检测ＮＩＣＣ ＴＦ表达阻断后对ＩＢＭＩＲ的抑制作用，为在胰岛同种 或异种移植中更有效地防止ＩＢＭＩＲ的发生提供以 ＴＦ为靶向干预的研究基础。 参考文献： Ｂｅｎｎｅｔ Ｗ，Ｇｒｏｔｈ Ｃ Ｇ，Ｌａｒｓｓｏｎ Ｒ，ｅｔ １ａ．Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｓｌｅｔｓ ｔｉｒｇｇｅｒ ａｎ ｉｎｓｔａｎｔ ｂｌｏｏｄ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉ－ ｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐａ・ ｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｕｐｓ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，２０００，１０５ （２）：１２５—１３３． ［２］ Ｂｅｎｎｅｔ Ｗ，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ｂ，Ｌｕｎｄｇｒｅｎ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｓｌｅｔｓ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｏｒ ｆａｔｅｒ ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ：ｐｒｏ－ ｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓＣＲ１ ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２０００，６９（５）：７１１－７１９． 【３］ Ｃａｎｔａｒｏｖｉｃｈ Ｄ，Ｂｌａｎｃｈｏ Ｇ，Ｐｏｔｉｒｏｎ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ ｐｉｇ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ［Ｊ］．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓ— ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００２，９（１）：２５－３５． ［４］ Ｂｅｎｎｅｔ Ｗ，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ｂ，Ｇｒｏｔｈ Ｃ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｂｅ— ｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｓｌｅｔｓ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ：ａ ｉｆｎｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ？ ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９９，４８（１０）：１９０７－１９１４． ［５］ Ｍｏｂｅｒｇ Ｌ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ－ ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｕｐｓ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，２００５，１１０（１）：１７－５５． ［６］ Ｏｚｍｅｎ Ｌ，Ｅｋｄａｈｌ Ｋ Ｎ，Ｅｌｇｕｅ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｂｒｏｇａｔｅｓ ｔｈｅ ｉｎｓｔａｎｔ ｂｌｏｏｄ・ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｒｇ— ｇｅｒｅｄ ｂｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｓｌｅｔｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍｅｌａｇａｔｒａｎ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌｎａｔａｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００２，５１（６）：１７７９－１７８４． ［７］ Ｃｏｗａｎ ＰＪ．ｄ’Ａｐｉｃｅ Ａ Ｊ．Ｔｈｅ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎ ｘｅｎｏｔｒａｎｓ． ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｉｎｃｏｍｐａｔｉｈｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｔｈｅｍ ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００８，１３（２）：１７８－１８３． ［８］ Ｃｒｉｋｉｓ Ｓ，Ｃｏｗａｎ Ｐ Ｊ，ｄ’Ａｐｉｃｅ Ａ Ｊ．Ｉｎｔｒａｖａｓｅｕｌａｒ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｉｎ ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００６，８２ （９）：１１１９—１１２３． ［９］ Ｃｏｗａｎ Ｐ Ｊ．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ［Ｊ］． Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００７，１４（１）：７—１２． ［１Ｏ］ ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｄｔ Ｄ Ｊ，Ｂｏｔｔｉｎｏ Ｒ，Ｃａｓｕ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｌｏｓｓ ｏｆ ｉｎ— ｔｒａｐｏｒｔａｌｌｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｉｓｌｅｔｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｎａｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ［Ｊ］． ｘｅｎｏｔｒａｎ。ｐｌａｎｔａｔｉ０ｎ，２００７，１４ （４）：２８８—２９７． Ｍｏｂｅｒｇ Ｌ，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ｈ，Ｌｕｋｉｎｉｕｓ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓ． ｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｔｉｒｇｇｅｒ ｏｆ ｄｅｔｉｒｍｅｎｔａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌａｎ— ｅｅｔ，２００２，３６０（９３５０）：２０３９・２０４５． ［１２］ Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ｈ，Ｌｕｋｉｎｉｕｓ Ａ，Ｍｏｂｅｒｇ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏ— ｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｌｅｔｓ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｉｓ ａｓｓｏ— ｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００５，５４（６）：１７５５—１７６２． ［１３］ Ｋｏｒｂｕｔｔ Ｇ Ｓ，Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｊ Ｆ，Ａｏ Ｚ，ｅｔ ａ１．Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９９６，９７（９）：２１１９－２１２９． ［１４］ Ｌｉｎ Ｃ Ｃ，Ｃｈｅｎ Ｄ，ＭｃＶｅｙ Ｊ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｔｉｓｓｕｅ ｆａｃ— ｔｏｒ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ－ ｔｉｏｎ，２００８，８６（５）：７０２－７０９． ［１５］ Ｌｉｎ Ｃ Ｃ，Ｃｏｏｐｅｒ Ｄ Ｋ，Ｄｏｒｌｉｎｇ Ａ．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｂａｒｒｉｅｒ ｔｏ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｔｅ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｍ— ｍｕｎｏｌ，２００９，２１（２）：７５—８０． ［１６］ Ｎｏｒｉｒｓ Ｌ Ａ．Ｂｌｏｏｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｔｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ，２００３，１７（３）：３６９－３８３． ［１７］ Ｂｅｒｍａｎ Ｄ Ｍ，Ｃａｂｒｅｒａ Ｏ，Ｋｅｎｙｏｎ Ｎ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｍａｒｇｉｎａｌ ｍａｓｓ ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ－ ｔｉｏｎ，２００７，８４（３）：３０８－３１５． ［１８］ Ｎａｇａｔａ Ｍ，Ｍｕｌｌｅｎ Ｙ，Ｍａｔｓｕｏ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｌｅｔ ｉｓｏｇｒａｆｔｓ ｂｙ ｓｅｖｅｒｅ ｎｏｎｓｐｅｃｉｉｆｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ，１９９０，２２（２）：８５５・８５６． （本文编辑彭敏宁）
