miR-21检测试剂盒及其在判断神经母细胞瘤预后中的应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110872627 A(43)申请公布日 2020.03.10

(21)申请号 201811026281.2(22)申请日 2018.09.04

(71)申请人 复旦大学附属儿科医院

地址 201102 上海市闵行区万源路399号(72)发明人 王作鹏　李凯　姚伟　柳龚堡　

宗雨晴　马阳阳　董岿然　(74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事

务所(普通合伙) 31268

代理人 吴桂琴(51)Int.Cl.

C12Q 1/6886(2018.01)

权利要求书1页 说明书7页序列表1页 附图2页

()发明名称

miR-21检测试剂盒及其在判断神经母细胞瘤预后中的应用(57)摘要

本发明属生物技术和医学检验领域，涉及一种用于神经母细胞瘤miR-21基因的检测试剂。本发明采用miR-21和管家基因引物制成检测试剂和检测试剂盒，检测神经母细胞瘤预后相关基因miR-21表达与管家基因的差异表达。本发明实施简便，有助于神经母细胞的预后判断，并通过及时随访达到改善预后的目的，为进一步揭示神经母细胞瘤的分子机制提供了基础参考数据。

CN 110872627 ACN 110872627 A

权　利　要　求　书

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1.一种神经母细胞瘤的检测试剂，其特征在于，该检测试剂包含miR-21基因的特异性引物。

2.按权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂包含管家基因的特异性引物。

3.如权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述的管家基因是U6基因。4.一种神经母细胞瘤的检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包含权利要求1-3中任意一项的检测试剂。

5.按权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒含有逆转录酶、缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂或者荧光染料。

6.miR-21基因在制备神经母细胞瘤预后判断的检测试剂中的应用。7.按权利要求6所述的应用，其特征在于，miR-21基因的特异性引物在制备神经母细胞瘤的检测试剂盒中的应用。

8.按权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒包括U6基因的特异性引物。

9.按权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒用于检测神经母细胞瘤的miR-21基因及U6基因的表达。

10.按权利要求7所述的应用，其特征在于，使用检测试剂盒检测样本的miR-21基因的表达，检测方法包括：

(a)检测miR-21基因的表达；和/或

(b)检测管家基因的表达；

(c)使用管家基因的表达校正miR-21基因的表达情况。

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说　明　书

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miR-21检测试剂盒及其在判断神经母细胞瘤预后中的应用

技术领域

[0001]本发明属于生物技术和医学检验领域，涉及一种用于预测神经母细胞瘤预后的检测试剂，还包括肿瘤组织中miR-21表达检测在判断神经母细胞瘤患儿预后的检测试剂中的用途。

背景技术[0002]神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是交感神经嵴细胞来源的儿童最常见的颅外实体肿瘤，起病隐匿、进展快、愈后差。美国儿童发病率约为9.4/百万，我国每年新增病例约3000例，占小儿所有恶性肿瘤的8％-10％。该肿瘤起病部位隐匿，病程发展迅速，65％的患儿初诊时已有骨髓、骨骼、远处淋巴结的转移，复发和转移是患儿死亡的主要原因之一。对于低危组一般手术切除即可，中危组一般采用手术结合化学治疗，目前对于高危组进展期神经母细胞瘤的疗效不满意，国外经强化疗+自体干细胞移植的IV期患儿，5年生存率仅34％左右。

[0003]目前临床上神经母细胞瘤患儿预后多根据nmyc基因的表达，UH和FH的组织病理分型，INSS分期，危险度分级等判断，较为复杂，因此寻找一种简便的、客观的、可检测的方法，帮助判断神经母细胞瘤预后及复发、指导治疗方案的制定已成为本领域研究人员较为关注的问题。

发明内容

[0004]本发明的目的是提供一种神经母细胞瘤预后相关的检测试剂。

[0005]本发明的另一目的是提供上述检测试剂在制备神经母细胞瘤患儿预后判断检测试剂中的用途。

[0006]微小RNA(microRNA,miRNA)，是机体内源性的分子，可以在转录后水平几百个靶基因，广泛参与细胞增殖、分化、细胞周期调节、细胞凋亡、侵袭和转移的过程。在机体的胚胎发育过程、肿瘤发生发展中起到重要作用。发明人前期通过miRNA芯片技术筛查并验证了miR-21为NB相关的重要靶miRNA，参与了对NB生物学特性的，并与肿瘤的恶性程度及不良预后有关。

[0007]本发明通过下述技术方案实现：

[0008]本发明提供了一种用于神经母细胞瘤的检测试剂，该检测试剂包含miR-21基因的特异性引物。

[0009]特异性引物是指能够作为引物扩增、获得不混杂有其他基因片段的目标基因的DNA。

[0010]较好的，所述的检测试剂包含管家基因的特异性引物，可以用作管家基因的是在各种组织细胞中稳定表达的基因，例如U6基因。[0011]更好的，所述的检测试剂还包含逆转录酶、缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂或者荧光染料中的一种或者几种。

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相应的，本发明提供了一种神经母细胞瘤相关的检测试剂盒，该检测试剂盒包含

miR-21基因的特异性引物。[0013]较好的，所述的检测试剂盒包含U6基因的特异性引物。[0014]检测试剂盒中还含有逆转录酶、缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂或者荧光染料中的一种或者几种检测试剂。[0015]另一方面，本发明提供了miR-21基因在制备神经母细胞瘤相关的检测试剂盒中的应用。

[0016]其中，所述的检测试剂包括miR-21基因的特异性引物。[0017]例如，在本发明的一个优选实施例中，以序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的引物对作为miR-21基因的特异性引物。[0018]较好的，所述的检测试剂包括管家基因的特异性引物。[0019]在本发明的一个优选实施例中，以序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的引物对作为U6基因的特异性引物。

[0020]使用特异性引物可以检测神经母细胞瘤的相关基因表达，例如miR-21基因及U6基因的表达。

[0021]本发明使用qRT-PCR作为基础的检测手段，包括检测miR-21表达量和管家基因的表达量。

[0022]具体的，该检测方法包括：[0023](a)检测miR-21基因的表达；[0024]和/或[0025](b)检测管家基因的表达；[0026](c)使用管家基因的表达校正miR-21基因的表达情况。[0027]本发明的离体实验结果表明，本发明在判断神经母细胞瘤患儿预后具有良好的准确性。根据INSS分期，IV期miR-21表达量94-153，III期为49-73，I-II期分布在12-19；分期越高，miR21表达越高。COG分组越高，miR21表达越高：miR-21表达量在高危组分布在78-118，在中危组分布在47-66，在低危组分布在10-13。通过本发明可以较为方便的判别神经母细胞瘤患儿的预后，从而指导临床治疗及随访，达到及时检测肿瘤预后进展的效果。[0028]本发明属生物技术和医学检验领域，涉及一种用于神经母细胞瘤的检测试剂。本发明采用miR-21和U6基因引物制成检测试剂和检测试剂盒，检测神经母细胞瘤预后相关基因miR-21表达与管家基因U6的差异表达。本发明实施简便，有助于神经母细胞的预后判断，并通过及时随访达到改善预后的目的，为进一步揭示神经母细胞瘤的分子机制提供了基础参考数据。

附图说明

[0029]图1.35例肿瘤标本的(每个三支副管)荧光定量Real-time PCR检测miR-21的扩增曲线。其中，阈值(threshold)为137(人工校正)，基线设置为自动的Drift correction OFF。

[0030]图2.不同分期间相对定量值的差异。[0031]图3.不同分组间相对定量值的差异。

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具体实施方式

[0032]实验方法：[0033]1、使用样品的RNA进行cDNA合成[0034]反转录反应体系如下：

[0035]

[0036]

2、在PCR扩增仪进行RT反应如下：

[0037]

[0038][0039][0040][0041]

反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存3、合成的cDNA用于实时定量PCR(1)体系配置如下：

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[0043]

(2)miR-21扩增的双向引物序列及条件如下：

[0044]

每一个cDNA都做三支副管，Ct值求平均值

[0046](3)反应条件：95℃，5min；35个PCR循环(95℃，10秒；56℃，15秒；72℃，20秒(收集荧光))。

[0047]为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到99℃(每5秒升高1℃)[0048]4、待测基因以内参校正

[0049]实时定量PCR时各样品加样量均为1μl，然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的1μl体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，我们使用U6(不同样品间表达量基本恒定)作为内参。[0050]U6的双向引物序列及条件如下：

[0045]

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反应条件：95℃，5min；35个PCR循环(95℃，10秒；56℃，15秒；72℃，

[0053]20秒(收集荧光))。

[00]为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到99℃[0055](每5秒升高1℃)[0056]5、结果及计算

[0057]对Real-time荧光定量PCR的结果运用2-△△CT法进行分析。2-△△CT表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到目的基因相对于管家基因的定量。

[0058]ΔΔCt＝(CtmiR-21–CtU6)实验组-(CtmiR-21-CtU6)对照组[0059]6、统计学处理

[0060]建立病例资料量化表格，应用SPSSl5.0统计分析，组间的比较采用方差分析或四格表或行列资料卡方检验及Fisher确切概率法，P[0065]所有标本术中移出体外后立即切取一部分迅速置于液氮中冷冻后-80℃保存备用，剩余送往病理室做病理检查，并取得患者的监护人或者家属知情同意。全部患儿均经病理证实为神经母细胞瘤25例，节细胞性神经母细胞瘤8例，节细胞瘤2例，详细记录肿瘤临床病理学参数。见表一[0066]表一，35例神经母细胞瘤患儿的临床病理参数资料

[0052]

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[0067]

[0068]

(三)

[0069]1.35例肿瘤标本的(每个三支副管)荧光定量Real-time PCR检测miR-21的扩增曲线(图1)。

[0070]2.临床病理资料与miR-21表达的相关性分析[0071](1)根据INSS分期，IV期12例，III期10例，I-II期13例；分期越高，miR21表达越高(见表二、图2)

[0072]表二为不同的分期miR21表达的比较

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[0073]

(2)高危组11例(31.4％)，中危组13例(37.1％)，低危组11例(31.4％)；COG分组越

高，miR21表达越高(见表三、图3)

[0075]表三为不同的危险度分级的miR21表达的比较

[0074]

[0076]

[0077]

上述实验表明，本发明的基于miR-21的试剂以及试剂盒能够对神经母细胞瘤进行

分类。

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序　列　表

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序列表<110> 复旦大学附属儿科医院<120> miR-21检测试剂盒及其在判断神经母细胞瘤预后中的应用<130> 20180808<160> 4<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 22<212> DNA<213> Artificial<400> 1tagcttatca gactgatgtt ga 22<210> 2<211> 16<212> DNA<213> Artificial<400> 2tgcgtgtcgt ggagtc 16<210> 3<211> 25<212> DNA<213> Artificial<400> 3gcttcggcag cacatatact aaaat 25<210> 4<211> 23<212> DNA<213> Artificial<400> 4cgcttcacga atttgcgtgt cat 23

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

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