无镁诱导培养大鼠海马神经元癫痫放电模型中延迟整流钾电流的变化

中国医科大学学报第40卷第3期2011年3月JournalofChinaMedicalUniversityVol.40No.3Mar.2011

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无镁诱导培养大鼠海马神经元癫痫放电模型中延迟整流钾电流的变化

郭凤1，孙威1，姚阳2，高青华1，闵冬雨1，封瑞1，胡慧媛1，蔡际群1，郝丽英1（1.中国医科大学药学院药物毒理教研室，沈阳110001；2.沈阳医学院生理教研室，沈阳110034）

摘要目的利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元癫痫放电模型来检测延迟整流钾电流的变化。方法采用新生

液，应用全细胞膜片钳技术记录神经元的放电情况及延迟整流钾电流。结果无镁诱导可使神经元延迟整流钾电流增大。结论电的基础病理机制相关。关键词doi

海马；膜片钳；癫痫放电；延迟整流钾电流

R96

文献标志码

A

文章编号

中图分类号

24h内Wistar大鼠，分离海马神经元进行原代培养。体外培养至12~16d时，无镁细胞外液处理神经元3h并恢复正常细胞外

延迟整流钾电流增大可能与无镁诱导体外培养大鼠海马神经元自发异常放

放电；无镁处理后的神经元存在自发的“癫痫样”

0258-4646（2011）03-0193-03CNKI：21鄄1227/R.20110212.0957.029

ChangesinDelayedRectifierK+CurrentinHippocampalNeuronsCulturedinMg2+鄄freeMediuminRatModelofEpileptiformDischarge

GUOFeng1，SUNWei1，YAOYang2，GAOQing鄄hua1，MINDong鄄yu1，FENGRui1，HUHui鄄yuan1，CAIJi鄄qun1，HAOLi鄄

（1.DepartmentofPharmaceuticalToxicology，SchoolofPharmaceuticalScience，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China；2.DepartmentofPhysiol原ogy，ShenyangMedicalCollege，Shenyang110034，China）ying1AbstractObjective

，cellularfluid，theneuronsshowedspontaneous“epileptiformdischarge”andthedelayedrectifierK+currentsignificantlyincreased.Conclu原sion

hippocampalneuronsculturedinMg2+鄄freemedium.Keywords

andthenthedischargeactivityanddelayedrectifierK+currentwererecordedbypatchclamp.Results

tureofhippocamplaneurons.After12to16daysofprimaryculture，theneuronsweretreatedwithMg2+鄄freeextracellularfluidfor3hours，

AftertreatedwithMg2+鄄freeextra原

modelofepileptiformdischarge.MethodsTodetectthechangesindelayedrectifierK+currentinhippocampalneuronsculturedinMg2+鄄freemediuminrat

Thehippocampaltissuewassampledfrom1鄄day鄄oldWistarratsandusedfortheprimarycul原

TheincreaseofdelayedrectifierK+currentmightberelatedtotheunderlyingmechanismofspontaneousepileptiformdischargein

hippocampus；patchclamp；epileptiformdischarge；delayedrectifierK+current

CA3区锥体神经元是痫性放电的初始位点［1］。研究

海马是癫痫的重要致痫病灶之一，其CAl与诱导原代培养大鼠海马神经元异常放电模型研究延迟整流钾电流的变化，进一步探讨无镁诱导神经元异常放电的作用机制。1材料与方法1.1材料

表明，体外培养的海马神经元在无镁细胞外液的作用下可形成异常放电，而异常放电的作用机制并不清楚。离子通道结构和功能的障碍均可引起痫性发作，而电压依赖性钾通道在保持神经元的膜电位和神经递质的释放过程中发挥重要作用［2］。延迟整流广泛分布于中枢神经系性钾电流的重要组成部分，统，特别是海马部位。本研究拟通过“无镁细胞外液”

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81001429，31071004，作者简介：郭凤（1980-），女，讲师，博士.通讯作者：郝丽英，E-mail：lyhao@mail.cmu.edu.cn收稿日期：2010-12-09

30670761）

钾电流（delayedrectifierK+current，）作为电压依赖

由中动物：新生24h内Wistar大鼠，雌雄不限，

国医科大学动物实验中心提供。

主要试剂与仪器：DMEM/F12培养基、Neu原

robasalTM鄄A鄄Medium、马血清、B27（Gibco）、胎牛血清、（Hyclone）（Sigma）D鄄Hanks液、胰蛋白酶、FITC标记（Olympus）羊抗兔IgG（中杉）、倒置显微镜、Ax原opatch200B放大器（AxonInstrument）数模转换器1.2方法

（AxonInstrument）。

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取新生24h内Wistar大1.2.1原代神经元的培养：

中国医科大学学报第40卷

自发性放电（图2B）度为50耀80mV“癫痫样”，放电频率为8耀20Hz；另一种是电压幅度为50mV左右的“楔形”放电（图2C）。

（DMEM/F12+15%血清）调整细胞密植液终止消化，

0.125%胰蛋白酶于37益培养箱消化15耀30min。种

鼠脑，显微镜下分离双侧海马置于D鄄Hanks液；

度为2伊105/cm2后种植于2.0cm伊2.0cm的盖玻片（2%B27+NeurobasalTM鄄A鄄上。3耀4d半量换饲养液Medium），体外培养1个月。

1.2.2无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元

（mmol：NaCl145，KCl2.5，CaCl22，放电：无镁液·L-1）HEPES10，Glucose10，Glycine0.001，用NaOH调MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES10，Glucose5.5，用NaCl13.6，K2ATP33，KOH调pH至7.4。将培Cl20.2，

养12d后的神经元放入“无镁”细胞外液处理3h后，重新放入含镁的正常细胞外液中培养。电阻为2耀5M赘。利用膜片钳电流钳技术在I-Normal模式膜片钳技术记录延迟整流钾电流：培养细胞A，spontaneousdischargeinnormalhippocampalneurons；B，sponta原

（mmol：NaCl135，KCl5.4，pH至7.4。细胞外液·L-1）Scalebars=20μm图1大鼠海马细胞的原代培养×400

Fig.1Primaryculturedrathippocampalneurons×400

：K-As原NaOH调pH至7.4。电极内液（mmol·L-1）partate50，KCl20，HEPES20，EGTA1，MgCl21，Ca原1.2.3

细胞外下，分别记录神经元在正常细胞外液、“无镁”液3h并恢复正常细胞外液的自发性发电活动。第12d后，应用膜片钳电压钳技术分别记录神经元在正常细胞外液、“无镁”细胞外液3h并恢复正常细胞外液的钾电流。钾电流的记录方法：在V-设定保持电位为-80mV，以10mV为clamp模式下，统计学分析neousrecurrentepileptiformdischargeinhippocampalneuronstreatedwithMg2+鄄freeextracellularfluid；C，wedgedischargeinhippocampalneuronstreatedwithMg2+鄄freeextracellularfluid.图2Fig.2无镁处理诱导培养海马细胞癫痫样放电步阶使膜电位由-60mV逐步去极化至+60mV，持续时间300ms，可记录到外向电压依赖性钾电流。1.3

所有数据均用SPSS12.0统计学软件进行处结果

海马神经元的培养

EpileptiformdischargeinculturedhippocampalneuronstreatedwithMg2+鄄freeextracellularfluid

理，结果以依表示，两组间比较用检验。22.1

2.3线的影响无镁对延迟整流钾电流的峰值与电流-电压曲

延迟整流钾电流为最后100ms激发出的外向钾电流的主要成分。用pClamp10.0计算出每个细胞（pA。的电容，电流值与电容之比为电流密度·pF-1）

无镁组（图3B）可使对照组（图3A）的峰密度值从

1（3.65依1.29）pA·pF原1增大到（9.09依2.41）pA·pF原（与

神经元12~24h后大部分贴壁，随时间延长形

培养第8天后，神经元可见态多变，突起逐渐增多，锥体形状，有轴突与树突，细胞富有立体感，细胞核呈空泡状，核仁清晰可见。第10天后，细胞之间通

（图1）过突触联系，可形成典型的神经网状结构，至28d培养液中有悬浮的细胞碎片。2.2海马自发性放电记录

对照组比较，<0.01，=6）。以各命令电压下的平

（pA·作均电流密度值pF原1）对相应的膜电位（mV）图，制得I鄄V曲线。结果显示，无镁组可增大不同膜电位下的平均电流密度，但曲线的形状无明显变化（图4）。3讨论

研究表明，无镁诱发的神经元自发的动作电位与癫痫发作时电生理活动相似，可以产生反复循环

可以记录到神经元（=用正常细胞外液处理，

（图2A）6）正常的自发性动作电位。经无镁细胞外液处理3h并恢复正常细胞外液后，神经元（=6）可一种是周期性的电压幅出现两种自发性动作电位，

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膜的静息电位、膜兴奋性和动作电位的形状与频率，在癫痫研究中近年来愈加受到重视。研究表明钾通道KCNQ2/Q3、KATP、、KV1.1在癫痫发病机制中起重最初发现要作用［5］。是一种重要的钾电流成分，于乌贼巨轴突。哺乳动物脑中的电流由多种电压依赖性钾通道亚型构成，包括KV1.1、KV1.2、KV1.5、KV2.2、KV3.1和KV3.2［6］。KV2.1、

以往众多研究发现，癫痫发作诱导的神经元活动增加、体内缺氧、谷氨酸刺激和实验性缺血能导致NG108鄄15细胞株中可以浓度依赖性的形式抑制

可能并且使的稳态激活曲线向去极化方向移动，

A，incontrolhippocampalneurons；B，inhippocampalneuronstreatedwithMg鄄freeextracellularfluid.2+

［7］

增加。Huang等［8］发现抗癫痫药左乙拉西坦在

是其在体内具有抗癫痫作用的药理机制之一。本研究显示与对照组相比，无镁组推测电流密度值增大，

增大可能与无镁诱导体外培养大鼠海马神经元自发异常放电的基础病理机制相关，具体的相

图3无镁处理对延迟整流钾电流的作用Fig.3EffectofMg2+鄄freeextracellularfluidon14121086420

-60-50-40-30-20-100102030405060ControlWithoutMg2+关机制则需进一步的实验加以证明。参考文献：［1］EngelJJr.Mesialtemporallobeepilepsy：whathavewelearned?［J］.［2］PadillaK，WickendenAD，GerlachAC，etal.TheKCNQ2/3selective

channelopenerICA鄄27243bindstoanovelvoltage鄄sensordomain［3］BlairRE，SombatiS，ChurnSB，etal.EpileptogenesiscausesanN鄄

methyl鄄d鄄aspartatereceptor/Ca2+鄄dependentdecreaseinCa2+/calmod原ulin鄄dependentproteinkinaseIIactivityinahippocampalneuronalEurJPharmacol，2008，588（1）：64原71.culturemodelofspontaneousrecurrentepileptiformdischarges［J］.site［J］.NeuronsciLett，2009，465（2）：138原142.Neuroscientist，2001，7（4）：340原352.Membranepotential/mV*<0.01vscontrol.图4无镁处理对延迟整流钾电流电流鄄电压曲线的影响Fig.4EffectofMg鄄freeextracellularfluidonI鄄Vcurveof2+的自发性“癫痫样”发电，而抗癫痫药物如苯巴比妥、苯妥英钠等都可以阻滞这类动作电位［3，4］［4］BlairRE，DeshpandeLS，SombatiS，etal.Prolongedexposureto

developmentoftolerancetoitsanticonvulsanteffectsinthehip原pocampalneuronalculturemodelofacquiredepilepsy［J］.Neu原［5］HahnA，NeubauerBA.Sodiumandpotassiumchanneldysfunctions

inrareandcommonidiopathicepilepsysyndromes［J］.BrainDev，［6］ChenX，JohnstonD.Propertiesofsinglevoltage鄄dependentK+chan原

nelsindendritesofCA1pyramidalneuronsofrathippocampus［J］.JPhysiol，2004，559（Pt1）：187原203.2009，31（7）：515原520.

ropharmacology，2009，57（3）：208原218.WIN55，212鄄2causesdownregulationoftheCB1receptorandthe

。本研究参照Sombati等的实验方法，利用无镁细胞外液模拟“癫痫微环境”，发现经无镁细胞外液作用3h后，神经元可周期性地出现电压幅度为50耀80mV“癫痫

自发性放电和“楔形”放电，从而证实我们建立了样”

癫痫神经元模型。本研究发现，培养神经元必须形成突触联系与网络结构，具有传递信息的形态学基础后，才能建立癫痫自发性发电的模型，而分散培养的海马细胞没有自发性动作电位。

立体感强的神因此，制备表面光滑、轮廓清楚、经细胞是进行膜片钳记录的必要前提。本方法培养的海马神经元具备适用膜片钳研究的前提条件，特

神经元和神别是需要与少量的胶质细胞混合培养，

经胶质细胞之间具有一定程度的信息传递。此种培封接率可达50%以养条件下的的神经元活性较强，

上，为进一步的功能实验奠定了良好的技术基础。

目前癫痫发病机制仍不清楚。钾通道决定细胞

［7］MisonouH，MohapatraDP，MenegolaM，etal.Calcium鄄andmetabolic

regulatesneuronalexcitabilityinresponsetoischemia［J］.JNeu原state鄄dependentmodulationofthevoltage鄄dependentKv2.1channel

［8］HuangCW，TsaiJJ，HuangCC，etal.Experimentalandsimulation

studiesonthemechanismsoflevetiracetam鄄mediatedinhibitionofingofactionpotentials［J］.JPhysiolPharmacol，2009，60（4）：37原

（编辑孙宪民，英文编辑陈

delayed鄄rectifierpotassiumcurrent（Kv3.1）：contributiontothefir原47.

rosci，2005，25（48）：11184原11193.

姜）

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