Ghrelin抑制棕榈酸诱导的大鼠内皮细胞凋亡及机制

张丹;王威;韩玲玲;陈颖;刘国良

【摘 要】目的 探讨ghrelin对棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡的作用及其与PI3K/Akt通路的关系.方法 大鼠主动脉内皮细胞在含0.3 mmol/L棕榈酸的DMEM培养基中孵育,培养基中加ghrelin及PI3K/Akt的阻断剂LY294002,流式细胞仪Annexin V/PI法检测凋亡,分光光度计检测caspase-3活性,Western blot检测总Akt及磷酸化Akt.结果 棕榈酸作用下大鼠主动脉内皮细胞凋亡率为30.30％±1.98％,显著高于对照组(5.01％±0.52％)(P＜0.01)；Ghrelin及棕榈酸共同作用下内皮细胞凋亡率为10.03％ ±0.90％,显著低予棕榈酸组(P＜0.01).Ghrelin引起Akt活化,PI3K/Akt阻断剂LY294002能阻断Akt活化并减轻ghrelin对内皮细胞凋亡的抑制作用.结论 Ghrelin能够抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡,可能部分是通过PI3K/Akt通路起作用.%Objective To investigate the effect of ghrelin on palmitate-induced apoptosis in rat aortic endothelial cells and the potential involvement of PDK/Akt pathway. Methods Rat aortic endothelial cells were cultured in DMEM containing 0. 3 mmol/L palmitate, with ghrelin and PDK/Akt inhibitor, LY294002. Apoptosis was detected using an annexin V-FITC/PI double staining assay. Spectrofluorometer assay caspase-3 activity. Western blot analysis was used to examine the expression of total Akt and P-Akt. Results The apoptosis rate of rat aortic endothelial cells in palmitate group is 30. 30% ± 1. 98% , which is significantly higher than that of the control group (5.01% ±0.52%) (P＜0. 01). The apoptosis rate of endothelial cells in the ghrelin and palmitate group is 10. 03% ±0. 90% , which is significantly lower than that of the

palmitate group (P ＜0. 01). Ghrelin induced Akt activation. PI3K inhibitor, LY294002 blocked Akt activation and alleviated the anti-apotosis effect of ghrelin in endothelial cells. Conclusions Ghrelin inhibits palmitate-induced apoptosis in rat aortic endothelial cells. The effect of ghrelin is potentially partly mediated by PDK/Akt pathway. 【期刊名称】《基础医学与临床》 【年(卷),期】2012(032)003 【总页数】5页(P291-295)

【关键词】Ghrelin;棕榈酸;凋亡;内皮细胞;PI3K/Akt 【作 者】张丹;王威;韩玲玲;陈颖;刘国良

【作者单位】中国医科大学 附属第一医院内分泌科,辽宁沈阳110001;中国医科大学 附属第四医院内分泌科,辽宁沈阳110032;哈尔滨医科大学附属第二医院内分泌科,黑龙江哈尔滨150086;中国医科大学 附属第一医院内分泌科,辽宁沈阳110001;中国医科大学 附属第一医院内分泌科,辽宁沈阳110001;中国医科大学 附属第一医院内分泌科,辽宁沈阳110001 【正文语种】中 文 【中图分类】R3.5

Ghrelin是一种由28个氨基酸组成的多肽，主要来源于胃，是生长激素的内源性配体［1］。近期有许多研究表明ghrelin具有心血管保护作用。细胞凋亡的增加与内皮受损及心血管疾病相关。游离脂肪酸参与导致内皮细胞功能失调、动脉粥样

硬化及炎性反应，棕榈酸是人体内含量最多的游离脂肪酸，能够诱导内皮细胞凋亡［2］。Ghrelin能够对多种外来刺激下的血管内皮细胞发挥保护作用，但关于ghrelin对棕榈酸作用下内皮细胞凋亡的影响研究较少。细胞磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Pphosphatidylinositol-3-kinase/Protein kinase B，PI3K/Akt)是细胞内重要的信号传导通路，参与调节细胞存活。已有研究表明该通路在ghrelin的保护机制中发挥重要作用［3－4］，本研究探讨 ghrelin对棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响及探讨与PI3K/Akt通路的关系。 1 材料与方法 1.1 材料

清洁级雄性Wistar大鼠［中国医科大学动物中心，合格证号SCXK(辽)2003-0009］，体质量(200±20)g;棕榈酸、BSA(Sigma-Aldrich公司);DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司);内皮细胞生长添加剂(Upstate公司);兔抗人Ⅷ因子抗原相关抗体(北京博奥森生物技术有限公司);胰蛋白酶(北京索莱宝公司);Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(Roche公司);caspase-3活性测定试剂盒(R＆D Systems公司)。抗磷酸化Akt和抗Akt抗体(Cell Signaling公司)。 1.2 大鼠主动脉内皮细胞的原代、传代培养及鉴定

取Wistar大鼠胸主动脉，组织贴块法行原代培养，差速贴壁法纯化细胞。第3～5传代细胞用于实验。组织块及细胞培养过程中使用DMEM培养基，其中添加20%胎牛血清、1%青-链霉素、0.15 g/L的内皮细胞生长添加物。内皮细胞鉴定采用免疫细胞化学法检测Ⅷ因子。

1.3 AnnexinⅤ-FITC/PI法检测细胞凋亡

各组细胞分别在BSA培养基和含0.3 mmol/L棕榈酸的培养基(PA)无血浆条件下干预24 h，100 nmol/L ghrelin(AG)每8 h加或不加入培养基中，阻断剂

20μmol/L LY294002(LY)在AG加入前30 min加入。用PBS洗细胞2次，0.25%

胰蛋白酶消化细胞，1 000×g离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS重悬细胞并计数。各取1×106个重悬细胞，1 000×g离心5 min，弃上清，加入195μL AnnexinⅤ-FITC结合液，重悬细胞。加入5μL AnnexinⅤ-FITC混匀。室温避光孵育10 min。1 000×g离心5 min，弃上清，加入190μL AnnexinⅤ-FITC结合液，重悬细胞。加入10μL PI染色液混匀，冰浴避光放置，流式细胞仪检测。 1.4 分光光度计检测caspase-3活性

各组细胞分别在BSA培养基和含0.3 mmol/L棕榈酸的培养基(PA)无血浆条件下干预24 h，100 nmol/L ghrelin(AG)每8 h加或不加入培养基中。用PBS洗细胞2次，2 000 r/min离心5 min，去除PBS，沉淀细胞中加入50μL冰冷裂解液和0.5μL DTT，冰上裂解60 min，4 ℃ 10 000 r/min离心1 min，加50μL 2×反应缓冲液/DTTMix，加5μL caspase-3底物(Ac-DEVD-pNA)，37℃ 4 h。分光光度计在400 nm波长测定其吸光度。 1.5 Western blot检测BCL-2和BAX

用含0.5%BSA的培养基作为对照组，用含0.3 mmol/L棕榈酸的培养基(PA)孵育细胞24 h后，100 nmol/L Ghrelin(AG)立即加入PA组作用0、15、30、60 min后行 Western blot检测。0.3 mmol/L棕榈酸的培养基(PA)孵育细胞24 h后，100 nmol/L ghrelin(AG)立即加或不加入PA组作用30 min。20μmol/L LY294002(LY)在AG加入前30 min加入，最后行Western blot检测。用RIPA裂解液裂解细胞，提取蛋白质，进行10%SDS-PAGE，1×TBS(pH 7.6)洗3次，转膜后5%脱脂奶粉封闭2 h，加一抗4℃孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记的二抗杂交2 h，洗膜后ECL超敏发光液进行显色，结果用Scion Image分析软件对目的条带进行吸光度值分析。 1.6 统计学分析

应用SPSS13.0统计软件进行分析，结果用均数±标准差()表示，每组实验重复3

次或3次以上，分析方法采用单因素方差分析，组间差异比较采用 Dunnett’s检验。 2 结果

2.1 Ghrelin对棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响

0.3 mmol/L棕榈酸作用24 h细胞凋亡率为30.30%±1.98%，显著高于对照组(5.01% ±0.52%)(p＜0.01);而ghrelin与棕榈酸共同作用下内皮细胞凋亡率为10.03% ±0.90%，显著低于棕榈酸组(p＜0.01);LY294002能够阻断ghrelin的作用(p＜0.01)(图1)。

2.2 分光光度计检测caspase-3活性

0.3 mmol/L棕榈酸作用24 h明显增加caspase-3活性(p＜0.01)，ghrelin显著降低 caspase-3活性(p＜0.05)(图2)。

2.3 Ghrelin对棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响与PI3K/Akt通路的关系

0.3 mmol/L棕榈酸作用24 h显著抑制Akt蛋白的磷酸化(p＜0.01)，而加入100 nmol/L ghrelin快速引起Akt蛋白的磷酸化激活，30 min达到作用高峰，持续至少60 min(图3)。固定ghrelin的作用时间为30 min，Ghrelin浓度依赖性地促进Akt磷酸化激活，100 nmol/L的浓度产生最大的效力(图4)。LY294002能够抑制Akt磷酸化(p＜0.01)(图5)。

图1 AnnexinⅤ-FITC/PI法检测细胞凋亡Fig 1 Apoptosis assessed by Annexin V-FITC/PI double staining 3 讨论

Ghrelin是生长激素的内源性配体，能够刺激生长激素分泌和通过依赖生长激素增加摄食和减少脂肪利用，从而导致能量正平衡。Ghrelin及其受体在心血管组织广

泛分布。作为一种多功能的多肽，Ghrelin在心血管方面的功能是目前的一个研究热点。Ghrelin通过抑制凋亡发挥对多种细胞和组织的保护作用，如皮质神经细胞［5］、肺［6］、脂肪细胞、胰岛 β细胞［7］、心肌细胞和内皮细胞［8］。Ghrelin 在不同环境所导致的内皮细胞凋亡中均发挥了抗凋亡作用，但ghrelin能否抑制脂毒性对内皮细胞的损伤的报道较少。本实验通过AnnexinⅤ-FITC/PI法检测提示ghrelin可以抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡。caspase家族是一组天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，是引起细胞凋亡的关键酶。目前认为caspase-3蛋白酶是细胞凋亡中最主要的终末剪切酶。本研究发现，ghrelin可以抑制高浓度棕榈酸引起的内皮细胞caspase-3活性增加，进而抑制细胞凋亡。本实验中通过对caspase-3活性的检测进一步证实了ghrelin能够抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡。

PI3K/Akt通路是体内一条重要的细胞生存通路，PI3K/Akt通路在细胞的凋亡、存活、增殖及血管生成等过程中发挥重要的生物学功能。Akt是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，也是体内重要的凋亡抑制蛋白，它可以诱导各种编码抗凋亡蛋白基因表达或通过信号耦联而抑制凋亡发生，Akt能在转录水平调节促存活和抗凋亡基因的表达，介导细胞因子和生长因子引起的细胞增殖、凋亡和存活。P13K活性的抑制能促进凋亡，而活化的Akt则能阻断凋亡。本实验通过研究进一步发现ghrelin可以迅速活化内皮细胞Akt，加入PI3K特异性抑制剂LY294002后ghrelin抑制棕榈酸诱导的内皮细胞凋亡作用减弱，该结果表明ghrelin至少部分通过PI3K/Akt通路发挥其在内皮细胞的抗凋亡作用。

本研究证实ghrelin可以抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡，且ghrelin的抗凋亡作用与PI3K/Akt通路有关。Ghrelin可能通过抑制内皮细胞凋亡在防治动脉粥样硬化中发挥一定的作用。

参考文献:

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［4］Liu K，Zhang W，Liu L，et al．Ghrelin inhibits apoptosis induced by high glucose and sodium palmitate in adult rat cardiomyocytes through the PI3K-Akt signaling pathway［J］．Requl Pept，2009，155:62 －69． ［5］Hwang S，Moon M，Kim S，et al．Neuroprotective effect of ghrelin is associated with decreased expression of prostate apoptosis response-4 ［J］．Endocri J，2009，56:609 －617．

［6］Chen J，Liu X，Shu Q，et al．Ghrelin attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury through NO pathway［J］．Med Sci Monit，2008，14:141 －146．

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