酸枣内生菌的筛选及其次级代谢产物的初步分离

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酸枣内生菌的筛选及其次级代谢产物的初步分离

邓振山袁魏婷婷袁高飞袁刘玉珍袁苏瑞袁陈邦凯袁莫达锐

渊延安大学生命科学学院袁延安苑员远园园园冤

摘要 为充分开发利用酸枣资源袁寻找生产黄酮类化合物等活性物质的内生菌袁为新型药物提供种质资源袁采用组织分离法尧划线分离法分离纯化酸枣茎的内生菌袁并用平板对峙法对抑菌活性进行测定遥抗菌活性较强的菌株有月原园愿原员圆和月原园愿原圆园袁抑菌圈直径达到渊猿员郾园园依园援苑愿冤皂皂曰并将菌株进行发酵袁用有机试剂萃取尧薄层层析以及紫外分光光度计作进一步检测遥薄层层析检测表明院月原园愿原圆园菌株的发酵产物在砸枣为园援源猿处有与酸枣茎提取液斑点砸枣值相同的显色斑点袁初步确定活性物质的种类为黄酮类或者其类似物遥关键词 酸枣曰内生菌曰拮抗性曰薄层层析曰黄酮类中图分类号 匝怨猿怨援怨文献标识码 粤文章编号 圆园怨缘原员苑猿远渊圆园员愿冤园员原园园源圆原园源

阅耘晕郧在澡藻灶鄄泽澡葬灶袁宰耘陨栽蚤灶早鄄贼蚤灶早袁郧粤韵云藻蚤袁蕴陨哉再怎鄄扎澡藻灶袁杂哉砸怎蚤袁悦匀耘晕月葬灶早鄄噪葬蚤袁酝韵阅葬鄄则怎蚤

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杂糟则藻藻灶蚤灶早燥枣藻灶凿燥责澡赠贼藻泽蚤灶在蚤扎赠责澡怎泽躁怎躁怎遭藻葬灶凿贼澡藻葬灶葬造赠泽蚤泽燥枣贼澡藻蚤则泽藻糟燥灶凿葬则赠皂藻贼葬遭燥造蚤贼藻泽

植物内生菌渊孕造葬灶贼藻灶凿燥责澡赠贼藻冤是存在于健康植物组织和器官中袁而被感染的宿主植物不表现出明显侵染症状的一类微生物遥对植物内生真菌研究发现袁其次生代谢产物十分丰富袁尤其是药用植物内生真菌中袁包括了萜类尧生物碱类尧苯丙素类尧黄酮类尧甾体类尧醌类尧糖类尧有机酸类尧脂类尧肽类等多种化合物咱圆暂袁内生真菌能合成黄酮尧生物碱尧萜类尧甾体等多种化合物袁其中大多数化合物具有抗菌尧抗癌尧生物防治等活性咱猿暂遥因此从植物内生菌中提取次生代谢活性物质的研究活动袁且已取得了较大进展遥植物内生菌不仅将植物作为其栖息场所袁而且对寄主有促生尧防病尧内生联合固氮等广泛的生物学作用袁是植物病虫害防治袁内生联合固氮菌筛选袁诱导抗病性及转基因载体的天然菌源袁具有较高的理论研究价值和实际应用价值袁已成为微生

物和植物学学科的研究热点咱源暂遥

虽然自月葬糟燥灶等咱缘暂从黑麦草种子中分离出第一株内生真菌至今已有员园园多年历史袁但直到圆园世纪猿园年代发现造成畜牧业重大损失的牧畜中毒是由于食用感染内生真菌的牧草后袁内生菌的研究才得以广泛的开展起来遥杂贼蚤藻则造藻等咱远暂从短叶红豆杉的韧皮部分离到一株能产抗癌活性物质紫杉醇的内生真菌袁这才引起人们对内生真菌产生抗肿瘤活性物质的极大注意遥

酸枣咱在蚤扎蚤责澡怎泽躁怎躁怎遭葬酝陨蕴蕴援增葬则援泽责蚤灶燥泽葬渊月怎灶早藻冤匀怎藻曾匀援云袁悦澡燥憎援暂系鼠李科植物遥我国北方野生酸枣资源十分丰富袁主要分布在太行山区遥酸枣肉中含有大量维生素悦和员怨种氨基酸袁其中愿种为人体必需氨基酸遥而且袁在酸枣中检测出猿员中微量元素袁其中怨种为人体必需微量元素遥近年来对酸枣活性成分的分析

收稿日期院圆园员远原员圆原园缘曰修回日期院圆园员远原员圆原圆苑

基金项目院国家级大学生创新训练计划项目渊圆园员猿员园苑员怨园园苑冤曰陕西省科技统筹创新工程项目渊圆园员圆运栽在月园猿原园圆原园猿冤曰陕西省科技统筹创

新工程项目渊圆园员圆悦郧载苑冤

作者简介院邓振山袁博士袁副教授袁主要从事植物内生菌资源开发和利用及环境微生物研究袁耘原皂葬蚤造院扎澡藻灶泽澡葬灶凿藻灶早圆员源岳员远猿援糟燥皂

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第猿缘卷第员期圆园员愿年圆月

生物学杂志允韵哉砸晕粤蕴韵云月陨韵蕴韵郧再

灾燥造郾猿缘 晕燥郾员云藻遭袁圆园员愿

和员药理作用进行了大量的研究工作员援 员材料 酸材料

与方法遥枣材料选用陕北野生酸枣袁大多采自延安大学后及延安市各个县袁采集酸枣侧枝袁采样后立即带回实验员援员援室员用清水冲洗干净渊孕阅粤冤院员冤 遥固供试培养基

员园园园皂蕴曰责匀马体分铃薯离自然圆园园培养基遥淤马铃薯葡萄糖琼脂培养基曰园援早曰员葡萄酝孕葬袁员圆员益糖圆园早曰灭琼菌脂猿园员愿皂蚤灶遥

早曰蒸馏水缘园郾早曰于牛肉膏蛋白胨培养基渊晕粤冤院牛肉膏猿早曰氯化钠员蛋白酝孕葬袁员圆员益胨员园早曰灭琼菌脂圆园员愿皂蚤灶遥

早曰蒸馏水员园园园皂蕴曰责匀苑郾圆曰早曰园郾硝盂酸高钾氏员一早曰号三培水养合磷基酸院可溶氢二性钾淀园郾粉缘圆园早曰七早曰水氯合化硫钠园郾缘责匀缘苑郾早曰七水合硫酸亚铁园郾园员早曰琼脂员愿早曰水酸镁苑曰园援员榆缘曰园援水琼员脂酝孕葬袁员圆员益培养基院琼灭脂菌圆园皂蚤灶遥

员园园园皂蕴曰薯员圆员益圆园园虞酝孕葬袁员圆员益改早曰良葡萄孕阅粤糖圆园培灭员愿早曰蒸馏水员园园园皂蕴曰责匀养菌早曰基圆园皂蚤灶遥

蒸馏院酸枣茎浸汁曰琼脂员愿早曰马铃早曰脂硝愚灭酸无菌铵机圆园水员园园园皂蕴曰责匀苑曰园援员酝孕葬袁猿郾盐皂蚤灶遥

园培早曰硫养酸基院磷酸二氢钾圆郾缘早曰硫酸镁园郾圆圆园圆园皂蚤灶遥

早曰蒸馏水员园园园亚皂蕴曰铁园郾责匀员早曰苑曰园郾磷酸员氢酝孕葬袁员圆员益二钾圆郾园灭早曰琼菌培圆冤液体发酵培养基遥上述员冤员援员援养圆基需园郾员酝孕葬曰园援员酝孕葬袁员圆员益种曰灭培养基不加琼脂遥供试指 供试指示菌示有菌

菌圆园皂蚤灶遥苑种袁具体见表员遥

栽葬遭造藻员酝蚤糟则燥遭藻泽表葬泽员供试指示蚤灶凿蚤糟葬贼燥则泽菌

蚤灶蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则赠贼藻泽贼晕燥援菌株燥枣编号种名杂责藻糟蚤藻泽

孕泽贼则葬蚤灶泽孕原孕原员圆金杂贼葬责澡赠造燥糟燥糟糟怎泽耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬糟燥造蚤孕原猿孕原柠檬伤黄大寒色肠杆菌沙葡萄门氏菌球菌孕原源缘福色葡萄球菌杂贼葬责澡赠造燥糟燥糟糟怎泽泽葬造皂燥灶藻造造葬

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区划线分离法进行内生菌分离尧纯化遥用冲洗干净的新鲜酸枣茎袁浓度为怨缘豫的源酒精浸泡猿皂蚤灶渊除去表状次况寅及浓采度取部为园援位员豫面的蜡层冤寅无菌水冲猿耀而定升冤汞寅浸泡无菌源水耀冲苑洗皂蚤灶渊源次根据遥无茎的生菌操作长袁将上述处理过的材料剪切成园援缘糟皂的小段或者削成薄片袁接种于平板培养基上渊用灭过菌的镊子轻轻按一

下缘接耀冤袁种苑每板到凿遥孕阅粤当缘观察耀远块培养到袁基组织置于猿远益依员益恒温培养箱中培养上培块边养袁设缘置有猿微生物个重复长出遥通过后袁将其四区划线分离法得到菌株纯培养物袁斜面源益保存咱愿暂表面消毒效果检测院将最后一次冲洗组织的遥

无菌水用灭过菌的涂布器均匀涂布于灭过菌的孕阅粤培养基上袁置于猿远益依员益培养箱中培养缘耀苑凿袁每个样设置员援圆援猿圆个重复袁检查是否将 已内筛生出菌来体的外内抑菌有微生物长出遥生菌活以性及测定

病原菌转接到牛肉膏固体培养基上扩大培养遥待培养基上长满内生菌后袁无菌条件孕阅月基培下取养基直径为渊圆缘园皂蕴员糟皂三角的瓶菌中加块猿入耀缘个接种于灭菌的圆源冤袁满牛澡遥置肉无于膏菌条件猿远益依员益恒温摇床袁员远园员园园则辕皂蚤灶皂蕴振液荡体员愿培养耀固体培下养袁基用上灭袁过直径菌的员园棉皂皂签将的病无原菌菌打均孔匀器涂在涂满病原菌的培养基上打孔并注入内生菌发酵液遥实验与耀源组凿设后置袁观察并测猿次重复袁量置于猿远益依员益恒温培养箱培养圆员援圆援实验猿组相同处理过的抑菌无菌圈水直径袁对袁照对组照设组置在孔中注入将 菌菌株株月液原体园愿发原酵猿次重复遥员圆袁月及产原物的园愿原粗圆园提

扩大培养袁无菌条件下袁取直径员糟皂的内生菌菌饼源耀缘块袁分别接种于含圆园园皂蕴的发酵液培养基中袁接种圆缘瓶袁共发酵缘蕴袁置于猿远益依员益尧员远园则辕皂蚤灶恒温震荡培养器中缘耀苑凿遥经水浴锅将其蒸干遥根据极性用等体积石油醚袁乙酸乙酯袁正丁醇尧甲醇依次萃取咱怨暂存袁浓缩后于源益冰箱保员援圆援备源用遥

员糟皂员冤 长酸酸枣枣茎植株体剪碎有处效理成遥分取提干取

净的酸枣枝条员圆冤的袁剪成溶小剂段提遥

取遥取酸枣茎的短段缘个袁料液比为澡颐置放员远袁减冷温压袁旋倾度转滤员园园益蒸出发溶袁加石油醚袁于索式提取器中回流约圆器剂中袁反回复收提溶取剂猿袁再次用袁合并无水袁乙滤醇过回袁滤流液提取猿次袁每次圆澡合并袁浓缩并回收乙醇袁得提取液袁经微员援圆援孔缘滤 膜薄过层层滤浓析缩咱员员暂袁置渊栽蕴悦冤于源益冰箱中备用遥钠溶员冤液混制合板渊遥过将程薄中层层可加析猿硅分耀胶析

源与滴园援无源豫水乙羧醇甲袁基起纤维素消泡作用冤袁充分研磨渊朝一个方向冤袁倒在员园糟皂伊缘糟皂玻璃板上袁铺匀袁轻微振荡袁使液体均匀水平静置晾干袁使用前员园缘益活化猿园皂蚤灶遥圆冤点样尧展开遥用毛细管分别吸取少量酸枣茎提取液尧菌株发酵液袁点于硅胶板底部袁以酸枣茎提取液提取液为对照袁每点重复点样几次袁晾干猿冤遥晶显点样后用氯仿颐甲醇渊员缘颐员冤混合液为展开试剂遥体的色砸枣封反应越闭展容遥碘晶开器后中体起袁完显始成色反应院挥干溶剂袁放在盛有碘线显距色斑点袁并中计算心其的距砸枣离值∕遥

展开源后

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起员援圆援始远线采 距用硅溶湿胶柱剂前沿的距离遥法装色柱谱袁法

先在层析柱内加入约员园糟皂高的石油醚袁打开阀门使之缓慢流出遥将硅胶与石油醚浸泡摇匀袁放入超声清洗仪中超声猿园皂蚤灶袁取出袁沿玻璃棒一次性转入层析柱内袁使硅胶沉积压实遥在硅胶顶端加一层滤纸片遥干法上样袁取上述萃取物用甲醇溶解袁用愿园耀员园园目的硅胶拌样袁小心加到硅胶顶端袁在其上面再加上一层滤纸片遥选用薄层色谱的展开剂氯仿颐甲醇渊员缘颐员冤作为洗脱剂遥收集分离出的馏分袁用薄员援圆援层层苑析检测合并相同组分遥吸 取紫猿外皂蕴分光光甲醇度至法

比色皿中袁放入哉灾圆源园园的样品池中校准基线遥取源中柱层析的分离物园援缘早于干燥的烧杯中寅用甲醇将其品耀远员援圆援池次愿中进寅用行干测定燥的遥胶头溶解滴管寅吸然取至后用微比色孔皿滤中膜袁放过入滤样缘杂贼葬贼蚤泽贼蚤糟泽实验 数据数据处采理

用酝蚤糟则燥泽燥枣贼耘曾糟藻造软件和陨月酝圆增圆园软件进行数据整理和统杂孕杂杂圆援 员结 果与分析

计遥采抑菌用平活板性对测定

峙法对分离到的圆园株内生菌进行初步筛选遥结果表明有猿株内生菌对一种或多种病原菌具有不同程度的拮抗作用袁占分离菌株总数的员缘豫遥这猿株均为内生细菌袁无内生真菌与放线菌遥筛选出的月圆园原圆园园愿株内生菌形态特征见表圆遥其中月原园愿原员圆袁有抗还性有原遥较圆园圆园广这谱俩株的株内拮具有生抗作较拮抗用强的菌袁对对抑菌苑苑种种活病指性原示袁菌菌并的中的且月原园愿原抑制缘种效均果见渊见表图猿遥员冤遥

其中袁月原园愿原员圆袁月原园愿原圆园抑菌现象明显葬为云蚤早员图月原员园愿月原原园愿员圆袁原员圆袁月月原原园愿原圆园对病原菌的抑制作用

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月原园愿原员圆袁月原园愿原圆园园愿对原病圆园原蚤灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶菌孕原员燥枣的责葬贼澡燥早藻灶蚤糟抑制作用曰遭遭葬糟贼藻则蚤葬为月原园愿

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相同表明的院月迁原移园愿率以原圆园及菌显株色发斑酵遥液由与图标圆可知月原园愿原圆园菌株发酵液有员个褐色斑点袁在砸枣值为圆缘源园郾灶皂源猿紫与外芦灯丁下对检照品视观察斑点袁可看砸枣值见园援有源猿一褐相同色点遥遥

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袁样品在圆园园耀远园园灶皂样品在圆园猿灶皂处有最大吸收峰遥经查文献对照黄酮类物质在圆园园耀远园园灶皂之间有吸收峰袁可以初步确定该猿 物质讨论为本实验结与黄结酮论

类物质遥果表明院不同的植物中内生菌的种类和数量有一定的差别袁通过抑菌试验初步筛选袁从酸枣茎中分离的圆园株内生菌中获得猿株具有较强抑菌效果的菌株袁占分离菌株数的员缘豫袁其中月原园愿原圆园的抗菌谱最广袁对源种不同的指示菌渊员袁圆袁猿袁源冤均有强烈的拮抗作用遥经薄层层析渊栽蕴悦冤分析表明袁月原园愿原圆园菌株的发酵产物可与碘蒸气发生特征性颜色反应而呈现月的原褐能力园愿色原斑点袁并通过紫外分光光度法进一步分析证明遥

圆园菌株可能具有可发酵产生酸枣黄酮类成分光谱图

纵坐标院韵阅值曰横坐云蚤早图标猿院波怎造贼则葬增蚤燥造藻贼猿紫外吸收长渊灶皂冤

葬遭泽燥则责贼蚤燥灶泽责藻糟贼则葬

在内生菌的筛选中袁共分离出圆园株菌袁其中员苑株为细菌袁真菌圆株袁放线菌员株袁细菌占了绝对优势遥这可能是酸枣茎中以内生细菌为主袁也可能与本实验技术尧方法尧条件的限制有关袁未能充分筛选出酸枣茎中所有的菌株袁特别是放线菌和真菌遥因此在筛选植物内生菌方面还有待于对传统的筛选条件进行改进袁采用更新型的筛选方法和技术袁从而充分挖掘优势植物内生菌资源遥

本实验通过薄层层析和紫外分光光度法证明了酸枣茎内生菌可产生与酸枣茎化学成分相似的化合物袁这与药用植物内生菌具有产生与宿主活性成分相同或相似化合物的能力的相关报道是一致的遥现在许多药用植物内生菌及其代谢产物的开发利用成为热点遥许多学者认为内生菌能合成与宿主相类似的代谢产物是由于它们具有相类似的代谢途径袁这些都为植物资源的保护提供了基础遥目前已有学者从其他植物中分离出黄酮类等活性成分袁但从酸枣茎分离出黄酮类物质以及产黄酮类化合物的内生菌的研究还未见报道遥本实验从酸枣茎中分离出月原园愿原圆园活性菌株产黄酮类成分袁这将为酸枣植株资源的有效利用奠定基础袁以及为黄酮类成分的提取提供另一个参考对象遥同时袁由于实验过程中提取方法尧展开剂尧显色剂尧色谱等条件的限制袁本实验只对月原园愿原圆园酸枣茎内生菌的黄酮这种产物进行了初步的提取尧分析袁并未涉及其他产物遥故仍需要利用其他生物化学手段进行提取尧纯化尧鉴定袁从而充分挖掘该菌株次级代谢产物的多样性遥

本课题旨在寻找生产黄酮类化合物等活性物质的内生菌遥虽然找到了具有发酵产生黄酮类化合物能力的内生菌袁但还未对其他拮抗菌株的其他活性成分袁也未对这株内生细菌进行分类尧鉴定尧分析及其代谢产物是否具有药用活性遥本课题不仅可作为新型药物的种质资源袁而且有利于维持生态平衡和植物资源保护遥

参考文献咱员暂张活新性研究国袁唐

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提取物的抗氧化

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