癫痫平片微生物限度检查法验证实验

样品：癫痫平片,批号140203、140204、140205，生产厂家为四川诺迪康威光制药有限公司。 菌种：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B) 26003]、 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]、 白色念珠菌(Candida a lbicans )[CMCC(F ) 98001]、 黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]，

乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B)50094] 均为第3代。由省药检所提供。 菌液制备

1．取经30～35℃培养18～24小时，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌肉汤培养物1ml加9 ml0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5 ～10-7，为50～100个/ml，做活菌计数备用。

2.取经26℃ 培养18～24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml加9 ml0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5 ～10-6，为50～100个/ml，做活菌计数备用。 3．取经26℃ 培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3～5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，取1 ml 加9 ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，逐管10倍稀释为10-4约50～100个/ ml，做活菌计数备用。 供试液制备

• 称取供试品10 g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，混匀，为1：10

供试液，分别人工污染上述5种试验菌株。 验证试验

1) 试验组：取1：10供试液1 ml和50～100cfu/ ml 试 验菌株同时加入平

皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养48～72小时观察结果。

2) 活菌组：测定每一菌株加的试验菌数 3) 供试品对照组：测定供试品本底菌数

4) 稀释剂对照组:考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。

试验组回收率测定结果 阳性菌 实验菌液组菌落数 试验组菌落数 供试品对照组回收率％ 次数 菌落数 1 79 77 75 77 8 10 85.9 大肠埃希菌 2 3 1 枯草芽孢杆菌 2 3 1 金黄色葡萄球菌 2 3 1 白色念珠菌 2 3 1 黑曲霉菌 2 3 88 85 86 80 83 86 78 81 88 86 85 87 88 85 80 83 82 86 81 85 92 90 45 44 87 80 38 40 93 88 40 44 77 82 45 50 78 76 50 53 75 82 46 49 77 71 35 32 69 68 36 45 74 69 38 39 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 85.5 83.4 88.5 83.8 88.1 39.0 35.9 36.5 48.4 55.2 49.0 33.1 46.0 41.3 回收率＝ （试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数×100％ 结果判断:从表结果可以看出：（1）采用常规方法检验癫痫平片供试品，人工污染5株代表菌株，该供试品对大肠埃希菌、枯草杆菌的回收率实验高于70%，可采用常规方法检验。（2）癫痫平片对金葡菌、白色念珠菌、黑曲霉有不同的抗菌活性，供试品回收率低于70%。该品种未经特殊处理（乳化、中和、分散、离心等），故未做稀释剂对照组试验。

表2培养基稀释法(1ml加5个平皿) 癫痫平片微生物限度检查验证 阳性菌 实验次菌液组菌落试验组菌落供试品对照组回收率％ 金黄色葡萄球菌 数 1 2 3 数 数 83 82 80 79 79 83 78 80 87 85 80 84 82 89 73 69 69 67 68 69 75 75 78 75 76 73 72 71 75 71 62 64 59 55 58 55 菌落数 4 8 11 8 11 8 11 8 11 8 11 8 4 8 4 8 4 8 89.1 85.2 89.2 79.7 79.9 78.4 80.3 75.0 73.8 白色念珠菌 1 2 3 黑曲霉菌 1 2 3 回收率＝ （试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数×100％ 从表2中的结果证明, 采用培养基稀释法检验癫痫平片供试品对人工污染金葡菌、白色念珠菌、黑曲霉的抑菌作用，回收率达到70%以上。因此，培养基稀释法可用于癫痫平片微生物限度检查。 结果判断及结论 ：

根据验证实验结果，确定癫痫平片微生物限度检查可采用培养基稀释法测定。(1ml加5个平皿) 控制菌检查方法的验证

菌液制备：取经30～35℃培养18～24小时的大肠埃希菌（制备同前）、乙型副伤寒沙门菌肉汤培养物1ml加9 ml0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至1ml含10～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。 乙型副伤寒沙门菌：80，85 大肠埃希菌（制备同前）：88，85 1.大肠埃希菌

（1）试验组 取供试液10ml及1ml大肠埃希菌菌悬液（10～100cfu），加入胆盐乳糖增菌培养基100ml中，依大肠埃希菌检查法进行检查。

（2）阳性菌对照组 取1ml大肠埃希菌菌悬液（10～100cfu）加入胆盐乳糖增菌培养基100ml中，依大肠埃希菌检查法进行检查。

（3）阴性菌对照组 取10mlPH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液加入胆盐乳糖增菌培养基100ml中，依大肠埃希菌检查法进行检查。

2.大肠菌群

（1）试验组 取乳糖胆盐发酵管3支，分别加入1:10稀释的供试液1ml及1ml大肠埃希菌菌悬液（10～100cfu）、1:100稀释的供试液1ml及1ml大肠埃希菌菌悬液（10～100cfu）、1:1000稀释的供试液1ml及1ml大肠埃希菌菌悬液（10～100cfu），依大肠菌群检查法进行检查。

（2）阳性菌对照组 取乳糖胆盐发酵管3支，分别加入1ml大肠埃希菌菌悬液（10～100cfu），依大肠菌群检查法进行检查。

（3）阴性菌对照组 取乳糖胆盐发酵管1支，加入稀释液1ml作为阴性对照，依大肠菌群检查法进行检查。 3.沙门菌

（1）试验组 取供试液10ml及1ml乙型副伤寒沙门菌菌悬液（10～100cfu），加入200ml营养肉汤培养基中，依沙门菌检查法进行检查。

（2）阳性菌对照组 取1ml乙型副伤寒沙门菌菌悬液（10～100cfu），加入200ml营养肉汤培养基中，依沙门菌检查法进行检查。

（3）阴性菌对照组 取10mlPH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，加入200ml营养肉汤培养基中，依沙门菌检查法进行检查。

结果判断及结论 ：

阳性菌对照组检出试验菌，阴性菌对照组无菌生长。试验组检出试验菌，通过控制菌检查方法的验证表明，按此供试液制备法和检查法是进行该供试品大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌三种控制菌检查的适宜的方法。

四川诺迪康威光制药有限公司

微生物限度检查实验组 2014年８月26日